镀铂的中孔金纳米酶用于葡萄糖、H?O?和癌细胞的超灵敏比色检测

《Microchemical Journal》：Platinum-decorated mesoporous gold nanozymes for ultrasensitive colorimetric detection of glucose, H?O?, and Cancer cells

铂修饰介孔金纳米酶（mesoAu@Pt）通过原位生长策略合成，具有高催化效率（Kcat达1.05×10^7 s?1）和优异稳定性，成功实现H?O?和葡萄糖的灵敏检测（检测限分别为0.1 μM和0.4 μM），并应用于癌细胞与正常细胞鉴别及血清样本分析。

　　

熊慧文|寸飞|卢远曦|刘恒|鲍成|叶大新|翁文豪

中国上海交通大学医学院附属上海儿童医院儿科感染、免疫与重症监护医学研究所临床实验室

摘要

尽管已经开发出许多过氧化物酶（POD）模拟物，但大多数仍然存在稳定性差和催化效率低的问题。在本研究中，通过原位生长策略合成了具有超高POD类似活性的铂修饰介孔金（mesoAu@Pt）纳米酶。介孔金纳米结构既作为载体稳定铂纳米颗粒（PtNPs），又作为支架增强其催化活性。由于PtNPs的均匀分布，单个mesoAu@Pt颗粒表现出优异的催化效率，其催化效率（K_cat）达到1.05 × 10⁷ s^?1。这种优化的纳米酶能够灵敏且选择性地检测H?O?和葡萄糖，分别实现了0.1 μM和0.4 μM的超低检测限，并具有宽的线性范围。H?O?的总检测时间（TAT）为15分钟，葡萄糖为45分钟。此外，mesoAu@Pt能够根据癌细胞和正常细胞内源性的H?O?释放情况区分两者，并在人血清样本中表现出与血糖仪相比低于6%的相对误差的可靠性能。这些发现凸显了mesoAu@Pt作为用于血糖监测、癌症诊断和下一代即时检测应用的强大且多功能的生物传感平台的潜力。

引言

纳米酶是一种被设计用来模拟天然酶催化功能的纳米材料，同时利用了纳米尺度系统的独特物理化学性质[1]，[2]。与天然酶相比，纳米酶具有更高的稳定性、易于合成和长期储存等优点，使其在生物传感和生物医学应用（包括诊断和药物输送[3]，[4]）中具有巨大潜力。已经使用多种材料来构建纳米酶，包括贵金属（如Au、Pd、Pt）[5]、金属氧化物（如Fe?O?、V?O?）、碳基纳米材料[6]、金属硫化物、金属有机框架及其复合材料[7]，[8]。纳米酶可以模拟多种酶活性，包括类似葡萄糖氧化酶（GOx）、过氧化物酶（POD）[9]、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的功能[10]。这种广泛的催化能力使它们能够用于检测多种目标，如病毒[11]，[12]，[13]、葡萄糖[14]、蛋白质[15]、金属离子[16]、肿瘤[6]，[17]、病原体[3]和抗菌剂。例如，李等人开发了一种负载铂的沸石，对检测人血清中的H?O?和果汁中的葡萄糖具有高灵敏度[18]。然而，沸石的狭窄孔结构限制了大分子底物向活性位点的扩散，导致响应时间延长。此外，微晶粉末容易聚集，进一步减缓了反应动力学。因此，许多纳米酶的催化效率往往低于预期，甚至低于天然酶，这对它们的广泛应用构成了挑战。

先前的研究报道了金纳米材料（AuNMs）的过氧化物酶（POD）类似活性[19]。金纳米颗粒（AuNPs）作为金纳米材料的一个代表类别，长期以来一直被认为是过氧化物酶（POD）的模拟物[20]。它们催化过氧化氢（H?O?）分解为羟基自由基（•OH），从而驱动显色底物的氧化[21]。然而，它们的催化效率相对较低，且化学稳定性因聚集而受到影响。介孔金（mesoAu）具有较大的表面积和丰富的修饰位点，克服了这些限制，提供了更好的催化性能。将铂纳米颗粒（PtNPs）负载到mesoAu上可以进一步提高活性，因为Pt提供了高效的催化中心[22]，[23]。与AuNPs相比，PtNPs表现出更好的催化性能[24]，能够更好地控制尺寸、分布和表面功能化，并且可以高精度和均匀地锚定在介孔载体上，满足高密度和单分散负载的需求。我们之前使用软模板策略开发了铂修饰的介孔金（mesoAu@Pt），结合了高表面积和稳定的Pt锚定。mesoAu@Pt的优势在于使用介孔材料来克服PtNPs催化剂的聚集和分离难题，从而提高了稳定性和催化效率。与自由纳米酶相比，这种多孔混合纳米材料由于其放大的催化活性和高负载能力，在早期诊断和临床分析中具有潜在优势[25]。这种双功能纳米酶表现出强烈的酶样活性，能够灵敏地检测葡萄糖、H?O?和其他临床相关的分析物，并在肿瘤检测和癌症治疗中显示出潜力[26]，[27]。

本文合成了三维介孔金，表面装饰有铂纳米簇（mesoAu@Pt）。通过原位生长策略，使用嵌段共聚物胶体溶液作为软模板，将Pt簇均匀沉积在介孔金骨架上。脂质体作为金原位生长的软模板，引导纳米颗粒形成过程，产生多分支的核壳空心混合结构，提高了mesoAu@Pt的胶体稳定性[28]，[29]。PVP中吡咯烷酮环的羰基氧和氮原子上的孤对电子捐赠给金离子的杂化轨道，将PVP牢固地锚定在介孔金表面[30]，[31]。在AA和H?PtCl?·6H?O的存在下，氯铂酸根离子被吸附并还原为Pt纳米颗粒，而PVP的疏水链的空间阻碍抑制了Pt纳米簇的聚集[32]。在合成过程中，氯金酸被抗坏血酸（AA）还原形成具有明确孔结构的mesoAu。与传统的铂修饰金纳米棒（AuNRs@Pt）和孤立的Pt纳米颗粒相比，mesoAu@Pt表现出显著更高的过氧化物酶类似活性。利用这种催化优势，我们构建了一个无标记的比色平台，用于灵敏地检测葡萄糖和过氧化氢。PtNPs在三维介孔金骨架内的牢固固定赋予mesoAu@Pt优异的活性和稳定性，为便携式血糖监测、体外癌细胞筛查以及早期疾病检测和个性化医疗提供了新的机会。

试剂和仪器

1,2-二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、胆固醇、抗坏血酸（AA）、白藜芦醇、牛血清白蛋白（BSA）、四氯金(III)酸氢盐三水合物（HAuCl?·3H?O）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、氯铂酸（H?PtCl?·6H?O）购自Aladdin Reagents Co., Ltd。过氧化氢溶液（H?O?）、乙酸（EtOH）和乙酸钠（EtONa）来自上海化学试剂有限公司。磷酸盐缓冲盐水（PBS）和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺溶液（TMB）由我们自行制备

mesoAu@Pt检测葡萄糖和H?O?的机制基础

采用软模板策略合成了均匀且稳定的mesoAu@Pt（图1A）。在水相中，带正电的脂质体与带负电的AuCl?^?离子发生静电相互作用。抗坏血酸（AA）将HAuCl?还原为金属金，这些金属金在脂质体模板上成核并生长，最终形成相互连接的三维介孔结构。去除脂质体后，AuNPs自组装成多孔的介孔金骨架。

结论与展望

本研究通过原位还原策略成功合成了mesoAu@Pt纳米酶，并系统研究了它们在H?O?分解中的催化机制。结果证实，H?O?的分解产生了羟基自由基，进而驱动了mesoAu@Pt的过氧化物酶类似活性。利用这些性质，建立了一个简单且稳健的比色平台，用于快速检测复杂样品（包括人血清）中的葡萄糖和H?O?

作者贡献

熊慧文、寸飞、叶大新和翁文豪提出了纳米酶传感系统的构想。熊慧文和寸飞合成了材料，进行了实验并撰写了手稿。卢远曦进行了优化实验并对手稿进行了深入修订。刘恒协助了编辑和修订工作。鲍成负责材料的合成。熊慧文、叶大新和翁文豪监督了整个研究过程。

所有作者均已同意最终版本

CRediT作者贡献声明

熊慧文：写作 – 审稿与编辑，撰写初稿，验证，监督，方法学，研究设计，概念化。寸飞：验证，方法学，研究，形式分析。卢远曦：写作 – 审稿与编辑，验证，形式分析。刘恒：方法学，研究。鲍成：方法学。叶大新：写作 – 审稿与编辑，监督，资源获取。翁文豪：写作 – 审稿与编辑，验证，监督，资源提供。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们感谢国家自然科学基金（82472962支持W. W.；22204096支持D. Y.）和上海市自然科学基金（24ZR1459800支持W.W.）的财政支持。