《Microchemical Journal》：2D-graphane grafted conducting paper-based electrochemical biosensor for the detection of liver cancer biomarker
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基于石墨烯纳米片和PEDOT:PSS涂层的纸基生物传感器，用于ANXA2生物标志物检测，实现肝细胞癌早期高灵敏度（4.28?μA[log(ng/mL)]?1?cm?2）低检测限（0.00032?ng/mL）诊断。传感器兼具机械柔韧性和环保特性。
切坦·拉梅什·加瓦利（Chetan Ramesh Gawali）| 潘卡吉（Pankaj）| 苏维恩·库马尔（Suveen Kumar）
印度古吉拉特邦甘地纳加尔艾哈迈达巴德国立制药教育与研究学院医疗器械系，邮编382355
摘要
本研究的目的是利用石墨烯纳米片和涂有聚（3,4-乙烯二氧噻吩：聚（苯乙烯磺酸盐）（PEDOT:PSS）的1级纸张，开发一种基于纸张的生物传感器，用于检测ANXA2生物标志物。该生物传感电极通过浸涂工艺制备而成。通过本克塞尔还原（Benkeser reduction）合成的石墨烯能够显著提高导电纸（CP）的机械柔韧性、信号稳定性和电化学性能。弯曲和折叠测试验证了所制备电极的柔韧性。此外，焚烧这种纸张传感器是一种安全有效的方法，不会产生烟雾或残留物。ANXA2抗体被物理吸附在制备的电极上，非特异性结合位点则用牛血清白蛋白（BSA）进行了封闭。使用X射线散射、透射电子显微镜、扫描电子显微镜和傅里叶变换红外光谱对制备的材料和电极进行了结构和形态学分析。构建的BSA/anti-ANXA2/Graphane/CP免疫电极显示出高达4.28 μA [log (ng mL^-1)^-1 cm^-2的灵敏度，检测限为0.00032 ng mL^-1，检测范围为0.001至50 ng mL^-1。
引言
柔性电子技术和人工智能的最新进展显著增加了人们对可穿戴和环境可持续技术的兴趣[1]。柔性电子系统对于可穿戴应用至关重要，因为它们提供了舒适性、安全性、机械柔韧性、高功率密度、可拉伸性和长期运行稳定性[2]。在各种柔性基底中，导电纸已成为开发低成本、便携式、轻量级和可生物降解电子设备的有前景的平台，特别是在即时诊断（POC）应用中[3],[4]。纸张因其易于获取、价格实惠以及以纤维素为基础的组成而被广泛用作传感基底。其固有的多孔结构和粗糙表面形态增强了分析物的吸附能力、毛细驱动的流体传输和反应效率，使其非常适合用于传感器制造[5]。对于电化学传感应用，理想的纸张基底应具有较大的表面积、足够的机械强度、高效的流体传输能力和导电性。Whatman 1级滤纸常用于实验室中的常规过程，如重力过滤、液体澄清和定性分析分离。由于其大约98%的α-纤维素含量和均匀的纤维结构，它已被广泛应用于学术研究、食品质量评估、农业研究以及环境监测（如空气污染分析）[6]。尽管具有这些优势，纸张本身不导电，因此在用于电化学设备之前需要对其进行表面改性。为了提高导电性，引入了各种导电材料，如金属氧化物和碳纳米材料；然而，这些材料可能会降低机械柔韧性。相比之下，导电聚合物在导电性、机械稳定性和电化学性能之间提供了有效的平衡[7],[8]。导电聚合物可以轻松沉积在纸张基底上，同时保持柔韧性和强烈的电化学活性[9]。在导电聚合物中，PEDOT:PSS因其结合了离子导电性和电子导电性、化学稳定性、机械柔韧性以及简单的加工方法而受到了广泛关注。PEDOT:PSS可以通过浸涂等简单技术均匀地涂覆在纸张基底上，从而形成适用于生物传感器制造的稳定导电界面。此外，将PEDOT:PSS与二维（2D）纳米材料结合使用可以显著提高传感器性能。各种2D材料，如氧化石墨烯、二硫化钼、二硫化钨、MXenes和六方氮化硼，表现出可调的带隙、高载流子迁移率和独特的量子特性[10],[11]。这些材料还提供了高表面积、优异的导电性和机械强度，这对于电化学传感应用非常有利[12]。为了提高导电性和柔韧性，本研究采用了石墨烯，这是一种具有化学结构（CH)n的石墨烯氢化衍生物。石墨烯最初由Sofo及其同事理论预测，随后通过本克塞尔还原方法合成，并由Geim及其合作者进行了实验研究[13]。石墨烯表现出多种吸引人的特性，包括高导电性、低带隙、低密度和优异的机械柔韧性[14],[15]。这些特性使其成为柔性电子、传感设备、储能系统和生物医学技术的理想候选材料。
从结构上讲，石墨烯由于sp2和sp3杂化碳原子的共存而具有独特的性质。这些杂化配置源于石墨烯的逐步氢化和还原过程。在此过程中，电子依次添加到类似苯的碳网络中，随后进行质子化步骤。最初，电子的添加会产生具有多种共振结构的自由基阴离子。当从乙醇或氨等弱酸中接受质子时，自由基中间体会再接受一个电子形成环己二烯基阴离子。该中间体通过相邻碳原子间的电荷离域而稳定，并在中心碳位点发生质子化[16]。在温和的反应条件下（如在液氨或乙二胺中回流），孤立的双键部分保持不变，碳框架内的共轭作用有限。部分氢化导致氢原子选择性地附着在特定碳位点上，破坏了均匀的sp2键合，将某些碳原子转化为sp3杂化状态。相邻的碳原子保留未配对的π电子，产生局部磁矩。这些磁矩共同排列，在材料内部产生自旋极化[17]。自旋极化引入了自旋依赖的电子传输，其中一个自旋通道的导电性高于另一个。因此，部分氢化的石墨烯比完全氢化的结构表现出更高的导电性。sp2导电域和sp3稳定区域的共存创造了连续的电子传输路径，同时实现了可调的磁性和半导体特性。因此，部分氢化改善了石墨烯的导电传输行为和机械强度。这些结合的电子、磁性和机械特性使得石墨烯在先进的技术应用（如自旋电子系统和基于纸张的生物传感器）中非常有吸引力。
肝癌仍然是全球最严重的健康挑战之一，在所有癌症中排名第六，并继续对医疗系统造成重大负担。预计到2025年，可能有超过一百万人受到肝癌的影响[19]。肝癌起源于肝细胞的恶性转化，通常与慢性肝功能障碍有关。肝细胞癌（HCC）是肝癌的主要形式，占肝癌相关死亡的约80-90%。近几十年来，发病率和死亡率持续上升，全球每年报告的新病例接近80万例[20],[21],[22]。预测显示，从2020年到2040年，肝癌发病率可能增加近55%，到2040年每年新病例数将达到约140万例[23]。肝细胞癌的发展与多种风险因素密切相关，包括乙型和丙型肝炎病毒感染、肝硬化、长期饮酒、黄曲霉素B1暴露、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、吸烟、威尔逊病和其他遗传疾病[24]。这些情况会促进肝脏的进行性损伤和癌变。因此，早期检测肝癌对于及时进行治疗干预和改善生存结果至关重要。传统的肝癌诊断方法包括甲胎蛋白（AFP）检测、活检检查、肝功能测试、超声成像、磁共振成像（MRI）、血管造影和计算机断层扫描（CT）。然而，这些技术通常只能在肿瘤生长到一定大小（通常超过3厘米）后才能识别出来[25]。此外，许多诊断程序具有侵入性、昂贵、耗时且对患者来说不适。这些限制突显了需要能够早期检测且具有更高灵敏度和患者便利性的替代诊断技术。电化学生物传感器作为快速准确检测肝癌生物标志物的有希望的替代方案应运而生。已经研究了多种生物标志物，如AFP、去γ-羧基凝血酶原（DCP）、糖蛋白-3（GPC3）和α-L-岩藻糖苷酶（AFU）。尽管AFP在临床中广泛使用，但其灵敏度和特异性往往有限。相比之下， Annexin A2（ANXA2）表现出更优越的诊断性能。临床研究表明，肝癌患者的ANXA2水平显著高于健康个体，临界浓度约为18 ng mL^-1，而在晚期病例中浓度可超过500 ng mL^-1。报告的诊断灵敏度范围为86%至100%，特异性为84%至91%，总体诊断准确率约为92%。因此，选择ANXA2作为开发肝癌诊断敏感生物传感器的目标生物标志物[26],[27]。
本研究首次报道了石墨烯在电化学传感器技术中的应用。所开发的传感平台结合了强烈的电化学活性、由于不含重金属或有害物质而具有环境安全性，以及早期检测肝癌的能力。此外，该系统采用简单的制造策略，使用环保材料，适用于下一代柔性且可持续的生物传感应用。
化学物质和生物分子
锂（Li）、乙二胺（C2H8N2）、叔丁醇（C4H10O）、异丙胺（C3H9N）和石墨烯纳米片购自TCI Chemicals。聚（3,4-乙烯二氧噻吩：聚（4-苯乙烯磺酸盐）（PEDOT:PSS）、磷酸氢二钠二水合物 [NaH2PO4·2H2O]、磷酸氢二钠二水合物 [Na2HPO4·2H2O]、六氰合铁（III）钾 [K3(Fe(CN)6]、六氰合铁（II）钾三水合物 [K4(Fe(CN)6)·3H2O]、氯化钠（NaCl）、ANXA2抗原和单克隆抗体
结构和形态学研究
如图1a所示，使用X射线衍射仪对X射线衍射图案进行了表征。除了2θ = 26.5处的强衍射峰（对应于石墨烯的100面）外，石墨烯的XRD图案还显示了43.6°和54.28°处的两个额外峰，分别对应于111面和002面[21]。图1展示了使用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜对石墨烯纳米片进行的形态学分析结果
结论
在本研究中，通过本克塞尔还原方法成功合成了氢化石墨烯，然后将其用于创建一种非常有效的电化学生物传感平台BSA/anti-ANXA2/Graphane/CP，用于检测肝癌的ANXA2生物标志物。评估了免疫传感器的电化学性能后，发现其检测范围为0.001 ng mL^-1至50 ng mL^-1，灵敏度为4.28 μA [log (ng m^-1)^-1 cm^-2。响应时间为14分钟
CRediT作者贡献声明
切坦·拉梅什·加瓦利（Chetan Ramesh Gawali）：撰写——原始草稿、验证、正式分析、数据管理。潘卡吉（Pankaj）：正式分析、数据管理。苏维恩·库马尔（Suveen Kumar）：撰写——审阅与编辑、验证、监督、资金获取、正式分析、概念构思。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
我们想感谢艾哈迈达巴德国立制药教育与研究学院的院长对这项项目的支持和鼓励。SK感谢Anusandhan国家研究基金会-总理早期职业研究（ANRF-PMECRG, ANRF/ECRG/2024/000857/LS）的财政支持。
