基于全面的分子数据集，研究中国亚科Acheilognathinae（鲤形目：鲤科）的系统发育与多样化

《Molecular Phylogenetics and Evolution》：Phylogeny and diversification of the subfamily Acheilognathinae (Cypriniformes: Cyprinidae) from China based on a comprehensive molecular dataset

本研究通过整合形态学与多基因分子数据（COI、Cyt b、EGR1、EGR2B、EGR3、RH、IRBP、RAG1），系统修订了中华沿岸软脊鱼亚科（Acheilognathinae）的分类，确认6个候选物种，揭示8个属级类群（含2个新类群），并估计其分化时间（Oligocene时期，约2.83亿年前）。研究证实了地理种群的特殊性（如A. barbatus和A. rhombeus），并建立了稳定的系统发育框架，为后续生物地理和进化研究提供基础。

　　

Jinhui Yu|Xin Chen|Ruyao Liu|Yongtao Tang|Meng Zhang|Yikai Li|Guoxing Nie|Chuanjiang Zhou

河南师范大学生命科学学院，新乡453007，中华人民共和国

摘要

Acheilognathinae是鲤科鱼类中的一个亚科，在东亚地区物种多样性非常高，尤其是在中国，这里分布着87个已知物种中的48个（其中36个是特有种）。为了澄清其分类学和系统发育关系，我们进行了综合研究，结合了形态学和多基因位点分子数据（COI、Cyt?b、EGR1、EGR2B、EGR3、RH、IRBP和RAG1），研究了277个代表42个物种级别的谱系的标本。我们的分析确定了六个候选物种，并建议对几个物种复合体进行修订，同时确认了A. barbatus和A. rhombeus内部的明显地理种群，并确定A. peihoensis是A. barbatulus的同义词。我们的系统发育构建将该亚科划分为八个得到充分支持的属级群组：Acheilognathus、Rhodeus、Tanakia、Paratanakia、Pseudorhodeus、Sinorhodeus、未命名支系1和未命名支系2（在本研究中新识别）。分化时间估计表明，Acheilognathinae在渐新世（约2837万年前）开始多样化，主要谱系在中新世开始辐射。这些结果大幅修订了Acheilognathinae的系统发育关系，突显了隐秘多样性的普遍存在，并为未来的生物地理学和进化研究提供了坚实的系统发育框架。

引言

作为最基本的分类单位，物种构成了生物学研究的基础（Schiebelhut等人，2018年）。物种的鉴定和描述是生物学研究的重要组成部分，因为缺乏分类单元可能会影响系统发育关系和分化时间估计的准确性（Hillis，1996年；Graybeal，1998年；Nabhan和Sarkar，2012年；Smith等人，2013年）。在一个多世纪的争论中，已经提出了近30种物种概念（Wilkins，2009年）。然而，物种分化是一个持续的过程，已识别的物种仅代表了这一进化轨迹的一个快照（Liu，2016年）。使用不同的物种概念和分类标准往往会导致物种边界的不一致性，从而导致分类的不稳定性（Agapow等人，2004年；Sites和Marshall，2004年）。因此，分类学家越来越多地提倡综合分类学，即在多学科框架内使用多种数据类型和分析方法（Leaché等人，2009年；Padial等人，2010年）。在这些方法中，传统形态学与分子系统发育的结合是物种分类中最常用的方法。

Acheilognathinae

，通常被称为苦鱼，属于鲤形目，包括小型、野生、杂食性的观赏鱼类。除了分布在欧洲的Rhodeus amarus和Rhodeus clochicus外，大多数Acheilognathinae物种分布在东亚和东南亚地区，包括中国、韩国、日本、越南和缅甸（Arai等人，2001年；Bogutskaya和Komlev，2001年；Veronese等人，2006年；Li等人，2017年；Bartáková等人，2019年）。大多数物种栖息在淡水湖泊和浅河的底部，而少数物种出现在清澈的岩石溪流中。这些鱼类因其与淡水贻贝独特的共生繁殖关系而受到广泛关注（Smith等人，2004年；Nelson等人，2016年；Li等人，2017年；Li等人，2020b年）。这种繁殖模式使苦鱼成为研究物种共同进化、生活史进化、适应进化、性选择、发育和配偶选择的重要模型（Chen，1998年；Liu等人，2001年；Yi等人，2021年；Yi等人，2024年）。

第一个Acheilognathinae物种是在一个多世纪前被描述的，但由于各国采样不完全、识别形态特征的挑战、物种间的同义词问题以及这些鱼类的小体型和形态多样性，这个亚科的确切有效物种数量仍然不确定（Sun等人，2018年）。不同的分类学家依赖不同的形态学和分子数据来进行物种分类（Jordan和Thompson，1914年；Matsubara，1955年；Wang，1958年；Arai和Akai，1988年；Meng，1996年；Yang，2010年；Chang等人，2014年；Nelson等人，2016年；Li等人，2017年）。近年来，描述了许多新的Acheilognathinae物种。根据《鱼类名录》，该亚科目前包括6个正式认可的属中的87个有效物种。其中，相当一部分多样性存在于中国，中国拥有约48个物种，其中36个是特有种。值得注意的是，分子系统发育研究揭示了额外的隐秘多样性，这些多样性可能尚未在正式分类中得到反映。例如，一些谱系，如在最近的系统发育研究中暂时称为“Acheilognathus”barbatus”或“未命名支系1”（Chang等人，2014年），被认为是不同的，但需要根据《国际动物命名法规》进行正式的分类修订和描述。与这种隐藏多样性的模式一致，我们的初步调查发现了一些缺乏正式拉丁学名的地理种群（表1）。例如，来自河南省淮河流域的一个种群，在此暂时被指定为“Acheilognathus” sp.7，就是一个这样的候选物种。此外，一些标本被暂时归类为或，但这些临时分类内的个体之间存在明显的表型变异。这一观察结果与Chang等人（2014年）的基因树分析结果一致，他们的分析表明和可能各自包含多个隐秘物种。这些观察结果表明，这些地方种群可能代表不同的物种或支系，表明Acheilognathinae的物种多样性可能被低估了。因此，需要一种综合的方法来对这些分类单元（包括假定的变种）进行分类并验证其分类的有效性。这是理解Acheilognathinae完整物种多样性的基本步骤，并为该亚科建立一个坚实的系统发育框架。此外，大多数新描述的Acheilognathinae物种都来自中国，这表明在中国还有很大的发现潜力（Li和Arai，2010年；Li和Arai，2014年；Li等人，2020c年；Li等人，2020a年；Chen和Shy，2024年；Huang等人，2024年）。因此，本研究重点评估了中国境内的Acheilognathinae物种多样性。

然而，关于Acheilognathinae的研究仍存在显著空白。尽管中国是一个物种多样性丰富的地区，但目前还没有统一的物种界定标准。许多新描述的物种是基于形态数据界定的，而没有结合多种证据进行验证（Arai等人，2001年；Li和Arai，2014年）。此外，基于广泛采样的中国Acheilognathinae的全面系统发育框架仍然缺乏。尽管仍在发现新的物种（Chen和Shy，2024年；Huang等人，2024年），但它们在亚科中的位置及其相互关系很少被探索。

为了解决综合分类框架中的空白以及中国这一群体缺乏全面系统发育的问题，我们对中国的大多数Acheilognathinae物种群体进行了综合分类分析。通过对中国收集的112个保存标本的形态鉴定和测量，结合237个个体的基因序列数据来评估物种多样性。分子数据集包括两个线粒体基因：细胞色素氧化酶亚基I（COI）和细胞色素（Cyt b），以及鱼类系统发育中常用的六个核基因：早期生长反应蛋白基因1、2B和3（EGR1、EGR2B、EGR3）、视紫红质（RH）、视网膜色素结合蛋白编码基因（IRBP）和重组激活基因1外显子3（RAG1外显子3）（Campbell等人，2013年；Chang等人，2014年；Li等人，2017年）。这个数据集代表了迄今为止对该群体最全面的系统发育分析，有助于对先前关于其属级群体的假设进行关键评估（图S1）。

利用这些数据，我们的目标是：（1）通过综合形态学和多基因证据，系统地澄清中国Acheilognathinae的物种多样性；（2）构建一个坚实的系统发育树，以评估物种的系统位置并测试当前属分类的有效性；（3）通过整合多种证据（包括表型（形态）差异、系统发育（单系性）支持、遗传距离和分子物种界定方法的结果）来强有力地支持物种的有效性。这项工作的结果为Acheilognathinae的进化历史提供了重要的数据基础和新的见解，并有助于建立稳定的分类系统。

样本收集和处理

通过野外调查和合作机构的贡献，共获得了277个Acheilognathinae标本。这些材料包括分布在中国的六个属级群组：Acheilognathus、Tanakia、Rhodeus、Sinorhodeus、Paratanakia和一个暂定为未命名支系1的谱系。对于仅分布于日本的（Pseudorhodeus），没有收集到实物标本；然而，其分子序列是从公共数据库中检索到的（Won

形态鉴定

通过对112个保存标本的形态学检查，基于计数、形态测量和定性特征，我们识别出了42个假定的物种级别谱系，这些谱系对应于34个目前被认可的有效物种。在这些谱系中，有六个表现出与已知分类单元一致的、可诊断的形态差异，因此被视为需要正式描述的候选物种。

物种界定结果

我们评估了物种

隐秘物种的发现

我们采用综合分类方法来评估中国Acheilognathinae的物种多样性。通过检查收集的标本并整合现有记录，我们确认中国是该亚科的重要多样性中心，拥有大量的谱系。

我们对样本的形态学和分子分析最初发现了42个假定的物种级别谱系。在这些谱系中，有一部分对应于28个目前被认可的有效物种，

结论

我们提出了Acheilognathinae的综合分类修订，结合了形态学检查和多基因位点分子系统发育（两个线粒体和六个核基因）。通过整合形态学和分子数据，实现了四个关键目标：（1）评估中国Acheilognathinae的隐秘物种多样性；（2）评估分类学上不确定的谱系的有效性；（3）构建亚科内的系统发育关系；（4）估计

CRediT作者贡献声明

Jinhui Yu：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，验证，软件，资源，方法论，正式分析，数据管理。Xin Chen：可视化，软件，资源，方法论，正式分析，数据管理。Ruyao Liu：软件，资源，方法论，正式分析。Yongtao Tang：软件，资源，方法论，正式分析。Meng Zhang：软件，资源，方法论，正式分析。Yikai Li：资源，方法论，数据管理。Guoxing Nie：

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢在样本收集过程中提供组织样本和参与收集工作的人员：丁琪琪、马凯和于丹博士（中国科学院水生生物学研究所）。本研究得到了国家自然科学基金（31872199, U2004146）的资助。