《MicrobiologyOpen》：Whole-Genome Sequence Profiling of Listeria innocua From Different Sources: Implications for Public Health
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本研究针对由食源性耐多药病原体引发的公共卫生挑战，以全基因组测序（WGS）技术为核心，深入解析了从南非食品和水源中分离出的两株无害利斯特菌（L. innocua）LIN_NWU_CNKT和LIN5_NWU_CNKT的毒力组（virulome）与耐药组（resistome）。研究发现，这两株菌的基因组携带有包括黏附（fbpA, inlJ）、侵袭（aut, inlA）和免疫调节（inlC, lntA）在内的多种毒力基因，以及介导对磷霉素（fosX）、林可霉素（lin）、四环素（tetM）和糖肽类（vanT）抗生素耐药的基因。结果揭示了这类传统上被视为“非致病”的环境分离株所潜在的致病基因库和耐药基因库，为理解其在“One Health”框架下的风险传播提供了关键基因组学证据，并强调了在食品加工环节加强标准操作规程以减少耐药性传播的紧迫性。
在全球化的今天，我们的餐桌越来越“国际化”，但伴随美食而来的，可能还有看不见的“隐形威胁”——食源性疾病。近年来，由细菌引发的食源性疾病暴发，特别是那些携带抗菌药物耐药性（Antimicrobial Resistance, AMR）的病原体，已构成严重的公共卫生挑战。其中，利斯特菌病（Listeriosis）可引起腹泻、头痛、呕吐等并发症，在南非的耐多药单核细胞增生利斯特菌（Listeria monocytogenes）引发的疫情后，更是被列入法定强制报告疾病名单。然而，焦点通常集中在“明星病原”单核细胞增生利斯特菌身上，而与其亲缘关系极近、通常被认为是“非致病”的无害利斯特菌（Listeria innocua）却较少受到同等关注。但事实真的如此“无害”吗？动物利斯特菌病的零星报告和其强大的环境适应性，不断敲响警钟。在“One Health”（同一健康，强调人类、动物和环境健康的整体性）理念日益重要的今天，了解食品链中所有潜在风险，特别是那些看似无害的细菌的“隐藏实力”，变得至关重要。
为了应对上述挑战，一支由南非西北大学（North-West University）等机构的研究团队，在Christ-Donald Kaptchouang Tchatchouang、Giulia Amagliani和Collins Njie Ateba等人的带领下，开展了这项研究。他们利用全基因组测序（Whole-Genome Sequencing, WGS）技术，对先前从南非西北省的食物（肉类）和水样中分离出的两株无害利斯特菌（分别命名为LIN_NWU_CNKT和LIN5_NWU_CNKT）进行了深入分析，系统评估了它们的毒力组、耐药组和系统发育特征。这项研究成果最终发表在学术期刊《MicrobiologyOpen》上，为我们揭开了“无害”利斯特菌不为人知的另一面。
研究人员在研究中主要应用了几项关键技术。首先，他们从样本中成功复苏了多药耐药（MDR）利斯特菌并进行基因组DNA提取。其次，利用Illumina MiSeq平台对菌株进行高通量全基因组测序，获得原始序列数据。接着，通过生物信息学流程对原始数据进行质量控制、修剪和de novo（从头）组装，得到高质量的基因组草图。之后，运用Prokka、RAST等工具对组装好的基因组进行功能注释，并利用PATRIC、VFDB、CARD等在线数据库和平台，分别对菌株的毒力基因、抗生素耐药基因（ARGs）进行预测和鉴定，同时构建系统发育树来分析其进化关系。
3 结果
3.1 基因组组装特征
对两株菌的测序数据进行组装后，得到其基因组基本信息。菌株LIN_NWU_CNKT的基因组大小为3,341,013碱基对（bp），而LIN5_NWU_CNKT为3,558,124 bp。两者的G + C含量分别为37.35%和36.66%。两株菌的基因组序列已提交至NCBI GenBank数据库，其中LIN5_NWU_CNKT获得了登录号JAVCAR000000000。分析表明，LIN_NWU_CNKT近乎完成图，而LIN5_NWU_CNKT为高质量草图，后者的部分片段化可能源于重复序列的组装挑战。
3.2 毒力基因检测
基因组分析揭示，两株菌均携带多种毒力基因。这些基因功能多样，涵盖了细菌感染和定植的关键步骤：
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黏附相关基因：包括编码D-丙氨酸-聚磷酸核糖醇连接酶的dltA基因、纤维连接蛋白结合蛋白的fbpA基因、自溶素的ami基因、内化素J的inlJ基因以及利斯特菌黏附蛋白的lap基因。LIN5_NWU_CNKT还携带了来自肠球菌的菌毛组装相关基因srtC1和胆盐水解酶基因bsh，这可能有助于其在肠道环境的存活。
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侵袭相关基因：包括自溶素aut、细胞壁水解酶iap/cwhA、细胞壁磷壁酸糖基化蛋白gtcA，以及至关重要的内化素A基因inlA。值得注意的是，LIN_NWU_CNKT携带了溶血磷脂酶C基因plcA，而LIN5_NWU_CNKT则携带有内化素B基因inlB、脂蛋白促进入侵蛋白基因lpeA和丝氨酸-苏氨酸磷酸酶基因stp。
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免疫调节相关基因：LIN_NWU_CNKT携带了inlC和lntA，而LIN5_NWU_CNKT则携带了inlK。
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调控与表面锚定相关基因：两株菌均携带多种双组分调控系统基因（如agrA/C, cheA/Y, virR/S等）以及表面蛋白锚定相关基因（lgt, lspA, srtA）。LIN_NWU_CNKT基因组中检测到了阳性调节因子prfA，该基因是单核细胞增生利斯特菌毒力基因表达的关键调控子。
3.3 抗生素耐药基因检测
两株菌的基因组中均被鉴定出多种抗生素耐药基因（ARGs），显示出多药耐药（MDR）潜力：
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共有基因：两株菌均携带磷霉素抗性基因fosX、林可霉素核苷酸转移酶基因lin，以及分别属于vanG和vanB糖肽类耐药基因簇的vanT和vanY基因。
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特有基因：菌株LIN5_NWU_CNKT还额外携带了四环素外排泵基因tet(45)和tet(M)，以及另一个磷霉素抗性基因Fosl。这些ARGs的耐药机制包括抗生素灭活、靶点修饰和外排泵外排。
3.4 系统发育分析
通过构建系统发育树，研究人员将这两株南非分离株与来自全球不同来源（包括临床和环境）的其他利斯特菌株进行了比较。分析显示，LIN_NWU_CNKT和LIN5_NWU_CNKT在进化上与先前分离的一些致病菌株关系密切。特别值得注意的是，它们与一株从英国分离的、被认为是“非持续污染”的无害利斯特菌参考菌株（UCDL085）亲缘关系很近，这提示无害利斯特菌的进化可能受生态环境选择驱动，地理隔离结构不明显，是一种全球分布的“世界性”环境物种。
4 结论与讨论
本研究通过对两株从食品和水中分离的无害利斯特菌进行全基因组测序分析，揭示了其基因组中蕴藏的、与侵袭力、致病性和多药耐药相关的遗传潜力。主要结论和重要意义体现在以下几个方面：
首先，研究证实了这两株传统上认为“无害”的利斯特菌，其基因组中携带了丰富的毒力基因库。这些基因覆盖了从黏附宿主细胞（如fbpA, inlJ）、入侵（如inlA, aut）到在宿主细胞内生存和免疫逃逸（如inlC, lntA）的多个关键致病环节。尤其重要的是，在LIN_NWU_CNKT中发现了关键的毒力调控基因prfA。这表明，这些环境分离株在遗传层面上具备了引发感染的“工具箱”，尽管其实际致病性仍需实验验证。这挑战了无害利斯特菌绝对安全的传统观念，提示其在特定条件下（如宿主免疫力低下）可能构成风险，尤其是在南非等有过严重利斯特菌病暴发史的地区，对这类菌株的监测不容忽视。
其次，研究发现两株菌均携带多种抗生素耐药基因，构成了对磷霉素、林可霉素、糖肽类和四环素等不同类别药物的耐药谱。耐药机制多样，包括酶促失活、靶点修饰和外排泵外排。其中，lin等基因可能通过可移动遗传元件（如质粒）从其他菌属水平转移获得。这意味着，存在于食品和水源中的无害利斯特菌，可能作为抗生素耐药基因（ARGs）的“储存库”，在复杂的微生物环境中，通过基因横向转移，将耐药性传递给真正的病原菌（如单核细胞增生利斯特菌），从而加剧临床治疗的困难。这突显了在“One Health”框架下，监控环境、食品和动物源细菌耐药性的重要性。
再者，系统发育分析表明，这些携带潜在毒力和耐药基因的菌株，与来自其他大陆的菌株（包括一株参考菌株）亲缘关系密切。这支持了无害利斯特菌作为环境微生物，其种群结构受生态因素影响大于地理隔离的观点。其基因组中发现的毒力相关基因，可能通过基因水平转移、基因复制和分化等机制从其他细菌获得。这种进化上的“灵活性”和全球分布的广泛性，意味着相关风险并非局部问题，而是需要全球协同监测的潜在公共卫生挑战。
最后，研究者特别强调，基因组检测到的毒力基因和耐药基因仅代表一种“遗传潜力”（genetic potential），而非实际致病行为（demonstrated pathogenic behaviour）的证据。许多毒力相关基因在利斯特菌属中普遍存在，可能参与细胞壁维持、环境适应等基础生理过程，而非特异的致病性。因此，解读这些发现需要谨慎。真正的风险评估需要结合基因表达分析、细胞感染模型乃至动物实验来验证这些基因的功能。
综上所述，这项研究通过对无害利斯特菌的深入基因组剖析，发出了重要警示：即便是那些被标记为“非致病”的细菌，也可能在食品链中充当毒力因子和耐药基因的潜在载体。在食品生产和加工环节，严格执行标准操作规程（SOPs），加强对所有利斯特菌属（而不仅仅是单核细胞增生利斯特菌）的监测，并利用全基因组测序等高分辨率技术进行主动筛查和溯源，对于预防食源性疫情、遏制抗生素耐药性传播、保障全球食品安全和公共卫生安全具有深远意义。
