《Phytochemistry》：Comprehensive genomic analysis reveals the class II diterpene cyclases in
Dodonaea viscosa
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Dodonaea viscosa的核基因组及完整叶绿体、线粒体基因组测序完成，鉴定出DvCPS和DvKPS两种类II二萜 cyclase酶，分别催化ent-copalyl pyrophosphate和ent-kolavenyl pyrophosphate的合成，为揭示其抗炎二萜类化合物生物合成途径奠定基础。
Kristin Helwig | Reuben J. Peters
罗伊·J·卡弗（Roy J. Carver），爱荷华州立大学生物化学、生物物理学与分子生物学系，美国艾姆斯市，50011
摘要
Dodonaea viscosa以其丰富的植物化学成分而闻名，并传统上被用作民间药物。数十年的研究致力于分离这种植物中的活性成分，包括独特的 Clerodane 和 Labdane 二萜类化合物。人们对 D. viscosa 中这些活性化合物的兴趣日益增加，这推动了对其生物合成途径的阐明，从而为通过合成生物学实现大规模生产提供了可能。本文提供了 D. viscosa 的核基因组草图以及完整的叶绿体和线粒体基因组序列，并对核基因组进行了注释。这些研究帮助发现了两种 II 类二萜环化酶 DvCPS 和 DvKPS，它们分别催化生成 ent-copalyl 焦磷酸和 ent-kolavenyl 焦磷酸，这两种物质是该药用植物中 Labdane 和 Clerodane 二萜类化合物的前体。
引言
Dodonaea viscosa（无患子科）是一种木质开花灌木，广泛分布于热带和亚热带地区的六大洲。它传统上被用作民间药物，用于缓解发热、皮肤病和其他炎症性疾病（Christmas 等，2015；Hossian，2019；Zhang 等，2012）。特别是这种植物的叶子在民间医学中有着悠久的应用历史，被制成酊剂、外用膏药、漱口液和蒸汽吸入剂（Hoffman 等，2025；Hossian，2019）。数十年的研究致力于分离其活性成分，其中包括在该植物中发现的独特 Clerodane 和 Labdane 二萜类化合物（Hoffman 等，2025；Niu 等，2010；Ortega 等，2001），这些化合物具有抗病毒（Zhao 等，2021）和保肝（Ali 等，2014）作用。
为了推动天然产物产业的发展，研究人员正在探索超越传统的植物提取和化学合成方法，特别是考虑通过合成生物学来获取这些活性成分，作为现有方法的替代方案或补充手段。已经有一些成功的二萜类化合物生产案例（Alberti 等，2023；Tong 等，2022；Zhao 等，2022）。要充分利用这一潜力，了解 D. viscosa 中的二萜类化合物生物合成机制至关重要，但目前这方面的认识仍然有限。尽管已经发表了关于 D. viscosa（L.）Jacq.（包括 ssp. angustissima 和 ssp. spatulate）的转录组分析（Christmas 等，2015），但这些研究尚未揭示其二萜类化合物的代谢途径。
二萜类化合物是迄今为止已知最大且结构最多样化的天然产物类别，目前已描述了超过 110,000 种（Zeng 等，2020）。Labdane 相关的二萜类化合物（LRDs）是这一类别中的重要组成部分，包含超过 15,000 种已知化合物（Mathieu 等，2024）。LRDs 的生物合成始于通过 II 类二萜环化酶（DTCs）对通用二萜前体 (E,E,E)-geranylgeranyl 焦磷酸（GGPP，1) 的 (生物) 环化，这一过程形成了定义该超家族的核心十烷环结构（Peters，2010）。通常，生成的产品会进一步由 I 类二萜合成酶（DTSs）进行反应，例如 ent-kaurene 合成酶（KSs），这些酶参与生长素（GA）植物激素的生物合成（Wang 等，2023；Zi 等，2014）。
植物编码了大量的 DTCs，不仅用于生产特定的代谢产物，还用于生成生长素（GA）植物激素。这需要 DTCs 产生 ent-copalyl-PP (ent-CPP，2)，这类 DTC 被称为 CPP 合成酶（CPSs）。研究表明，CPSs 的基因复制和新功能化导致了植物中 DTCs 及其产物的多样性（Peters，2025）。这些酶采用了一种经过充分研究的酸碱催化机制（图 1）。具体来说，DTCs 利用高度保守的富含天冬氨酸的 DxDD 动机来质子化 GGPP 的末端双键（Prisic 等，2007），从而引发一个碳正离子级联反应，该反应最终形成烯烃或在水分子作用下生成羟基化产物（Peters，2025）。根据 DTC 活性位点对底物的预处理方式，可以形成四种立体构型（正常、ent、syn 或 ent-syn）。此外，主要有三种碳骨架结构：labdane、halimane 或 clerodane。如果反应以最初形成的碳正离子中间体 labda-13E-en-8-yl+-15-PP 结束，则会产生如 CPP（labda-8(17),13E-dien-15-PP）之类的 labdane 类化合物。然而，碳正离子可以通过连续的 1,2-氢转移和甲基转移形成 halimane 骨架，再通过另一组连续的 1,2-氢转移和甲基转移形成 clerodane 骨架（Peters，2010）。实际上，生成的 kolav-13E-en-4-yl+-15-PP 可以被最初质子化底物的同一残基去质子化，形成 kolav-3,13E-dienyl-PP（KPP），相关的 DTCs 更准确地称为 KPP 合成酶（KPSs）。
因此，Dodonaea viscosa 中结构独特的二萜类化合物属于 LRD 超家族，因此需要至少两种不同的 DTCs 分别参与 labdane 和 clerodane 骨架的生成。通过全面的基因组分析，本文报告了高质量的 D. viscosa 核基因组序列（接近完成）。后续的基因组研究鉴定出两种 DTCs，它们通过生化实验被证实能生成 ent-CPP (2) 或 ent-KPP (3)，分别命名为 DvCPS 和 DvKPS。总的来说，这篇报告为未来研究 D. viscosa 中不寻常且具有生物活性的 LRD 天然产物的生物合成提供了坚实的基础。
节选内容
在 D. viscosa 基因组中鉴定出多种 DTCs
为了研究 D. viscosa 中的二萜类化合物生物合成，从一株种子培育的幼叶组织中分离出高分子量的 DNA（28 kb-80 kb，4.06 μg）（Kang 等，2023）。制备了两个 Oxford Nanopore Ligation 文库，并在 GridION 流式细胞上进行测序，共获得 895,450 个读段，平均读长为 11.18 kb（N50 23.9 kb），生成了 10.58 GB 和 8.4 GB 的碱基序列。
使用 Flye 进行基因组组装
结论
通过基因组测序、同源性建模、分子克隆和表达谱分析，在 Dodonaea viscosa 中鉴定出两种 II 类二萜环化酶（DTCs）。这是首次在 Sapindales 目中鉴定出的 DTCs，也是首次完成组装并注释的 Dodonaea 属基因组。DvCPS 生成生长素（GA）生物合成所需的 ent-CPP。相比之下，DvKPS 被证实能生成 ent-KPP，因此可能参与更复杂的生物合成过程
化学试剂
除非另有说明，所有化学试剂均购自 Fisher Scientific，分子生物学试剂购自 Invitrogen。
植物材料
Dodonaea viscosa Jacq. 种子（登录号 WLP 562，AZ930-372）来自 USDA-ARS 种质资源信息网络。植物在 16 小时的光照周期下生长，日出前 30 分钟开始补充光照。CRediT 作者贡献声明
Kristin Helwig：撰写原始草稿、进行研究、争取资金、进行正式分析。Reuben J. Peters：撰写修订稿、进行监督、争取资金、进行正式分析、提出研究概念。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
作者感谢爱荷华州立大学 DNA 实验室在提取、文库制备和基因组测序方面的支持，同时也感谢爱荷华州立大学生物信息学和计算生物学团队在基因组组装和注释方面的工作。本研究得到了 Kemin Industries 的大力支持。部分研究在 Kemin 的设施中进行；然而，Kemin 未参与研究设计、数据收集与分析、发表决定或结果整理等工作。
