《Protein Science》：From the cytosol to the inner membrane: biogenesis of the mitochondrial carrier family
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本文综述了线粒体载体蛋白（SLC25家族及其相关成员）的生物发生过程，重点阐述了其从胞质合成、经TOMM70/TIM22复合物跨膜转运直至整合至线粒体内膜的分子机制。文章系统总结了载体蛋白的靶向信号、胞质/膜间隙分子伴侣（如HSP90、TOMM34、TIMM9/10）的递送作用，以及内外膜转运机器（TOM、TIM22）的协同工作，并探讨了生物发生机器（如TOMM7、AGK、TIMM29）或载体蛋白自身（如SLC25A13）功能异常所导致的多种人类疾病（如Sengers综合征、Citrin缺陷症），强调了此通路在细胞代谢与人类健康中的核心作用。
1 引言
线粒体是细胞的能量工厂和代谢中枢，其高效运作依赖于内膜上大量的转运蛋白。其中，溶质载体（SLC）蛋白家族，特别是SLC25亚家族，构成了最大的线粒体代谢物转运蛋白群体。它们在细胞能量（ATP）产生、氨基酸合成、氧化还原平衡和离子稳态等广泛的代谢途径中发挥着至关重要的作用。线粒体双层膜构成了一个严格控制物质进出的微环境，而载体蛋白正是穿梭于其中，负责转运核苷酸、离子、代谢物、辅因子和维生素等底物。本文旨在综述当前对哺乳动物细胞中线粒体载体蛋白生物发生的理解，并阐明该通路的扰动如何深刻影响人类健康。
2 支持线粒体载体蛋白生物发生的阶段
2.1 一级结构与靶向信号
大多数线粒体载体蛋白并不含有N端的典型前导序列，而是拥有内部的靶向元件。唯一的例外是线粒体柠檬酸载体（CIC，SLC25A1），其N端前导序列有助于蛋白溶解性但不提供靶向信息。典型的SLC25家族成员包含三重重复的结构域，每个重复由两个跨膜的疏水螺旋及其之间的亲水基质环（螺旋-环-螺旋）构成。一个保守的载体基序P-X-[D/E]-X-X-[K/R]-X-X-Q在每个重复中出现一次，位于基质环附近的螺旋1、3和5中。带正电荷的基质环被证实可提供部分线粒体靶向信息，其正电荷被认为提供了将蛋白定向插入膜的电泳驱动力。
有趣的是，尽管大多数SLC25家族成员共享嵌入内膜的载体结构域，但天冬氨酸/谷氨酸载体SLC25A12（aralar）和SLC25A13（citrin）在N端拥有调节结构域，C端结构域则位于膜间隙。N端调节结构域由8个EF-hand基序构成，形成一个拱形结构，而较小的C端结构域包含一个与调节结构域相互作用的双亲性螺旋。与SLC25家族中以单体形式作用的成员不同，citrin和aralar通过调节结构域中的EF-hand基序形成稳定的同源二聚体。
2.2 穿越胞质及递送至TOM复合体
载体蛋白的输入是翻译后发生的。疏水的载体前体蛋白与胞质分子伴侣结合，以防止其聚集并支持其递送至TOM复合体。在此过程中，两个主要的胞质分子伴侣发挥关键作用：HSP70（亦称HSC70）和HSP90。HSP70结合前体蛋白中短的疏水或芳香族片段，而HSP90二聚体优先结合暴露的疏水和带电荷残基。共伴侣蛋白TOMM34与HSP70和HSP90二聚体组装形成三级伴侣复合体，结合共因子并水解ATP，进而促进线粒体前体蛋白转运至TOM复合体。TOMM34的表达水平和磷酸化状态可调节线粒体前体蛋白的输入。
2.3 载体蛋白在TOM复合体上的识别
TOM复合体是线粒体前体蛋白输入的主要入口，估计有90%的线粒体蛋白质通过此门进入。TOM复合体由中心成孔蛋白TOMM40、受体蛋白TOMM20、TOMM22、TOMM70以及辅助蛋白TOMM5、TOMM6、TOMM7组成。TOMM20和TOMM70对结合不同输入通路的底物具有不同的偏好性。TOMM20优先结合含N端前导序列的蛋白质，而TOMM70是载体生物发生途径中的核心受体，通过直接与HSP70/90伴侣复合体相互作用来促进载体前体蛋白的输入。TOMM70含有三个N端TPR结构域，形成了一个与伴侣蛋白C端EEVD共有基序相互作用的特殊夹子，将胞质伴侣复合体锚定在TOM复合体上以促进蛋白质输入。ATP水解后，载体前体从伴侣复合体释放到中心TOMM40孔，并被送入膜间隙。
2.4 穿越膜间隙
在穿过TOM复合体后，疏水的载体前体被小的TIM伴侣蛋白捕获。在从酵母到人类的所有物种中，小TIM蛋白的特征是含有成对的CXC3基序，人类家族包括TIMM9、TIMM10A、TIMM10B、TIMM8A/B和TIMM13。这些小TIM蛋白以交替的TIMM8/13或TIMM9/10A亚基形成螺旋桨构象的六聚体复合物。其中，TIMM9/10复合物在酵母和哺乳动物细胞中都被证明可以伴侣载体底物，而TIMM8/13的确切功能则不太明确，在人类细胞中，它们被发现是细胞色素c氧化酶（Complex IV）的组装因子。
在酵母中，Tim9/10六聚体在载体前体易位穿过TOM复合体后与其疏水片段结合，并将其伴侣至TIM22复合体，以便转移给Tim9/10/12复合物。相比之下，在哺乳动物细胞中，TIMM9/10A六聚体与内膜的膜间隙面结合，而TIMM9/10A/10B六聚体则与TIMM22结合。只有一小部分人类TIMM9/10A/10B六聚体存在于TIM22复合体上，这表明在高等真核生物中，前体的传递可能更具动态性。冷冻电镜和化学交联研究已解析了哺乳动物TIM22复合物的结构，确定了TIMM9/10A和TIMM9/10A/10B伴侣复合物在TIM22上的多个结合位点，为理解前体转移的化学计量学提供了见解。
2.5 通过TIM22复合体将载体整合入内膜
人类的TIM22复合体由核心蛋白TIMM22、酰基甘油激酶（AGK）和TIMM29，以及膜相关的TIMM9/10A/10B六聚体组成。早期研究曾提示酵母中存在双Tim22孔，但最近的冷冻电镜研究提示，酵母和人类成熟的TIM22复合体中只有一个TIMM22亚基。TIMM22的四个跨膜结构域在膜内形成一个横向通道，TIMM29则稳定复合体，并通过其膜间隙结构域直接与小的TIM蛋白和AGK相互作用。AGK最初被描述为磷酸化单酰基甘油和二酰基甘油的脂质激酶。虽然AGK的脂质激酶活性被发现对线粒体载体蛋白的输入是非必需的，但其激酶活性的丧失会影响内膜嵴的排列、OPA1加工和线粒体呼吸。化学交联和冷冻电镜研究表明，TIM22复合体存在小TIM六聚体的多个结合位点，TIMM22、TIMM29和AGK各自与TIMM9/10A或TIMM9/10A/10B相互作用。
有趣的是，人类线粒体存在一些复杂的差异，可能支持TIM22处蛋白质插入的替代机制。最引人注目的是，TIMM29直接与TOMM40相互作用，形成了一个TOM-TIM22超复合体，这可能介导了前体转移，类似于前导序列前体通过TOM-TIM23超复合体进行的协调易位。在酵母中未报道过TOM-TIM22超复合体，这支持了人类细胞中存在不同的易位机制。相反，酵母中的外膜蛋白VDAC已被证明通过与TIMM22复合体相互作用，在外膜和内膜之间形成接触，从而促进载体前体向TIM22复合体的转移。在酵母中，Tim9/10伴侣蛋白帮助载体前体穿过膜间隙，但在人类细胞中，同等的伴侣复合体被发现与膜的结合更紧密。这些发现挑战了在高等真核生物中，TIM22底物是否像在酵母中那样以可溶性伴侣中间体的形式穿过膜间隙。
3 线粒体载体蛋白生物发生与疾病
线粒体载体生物发生相关疾病可分为三类：（i）蛋白质生物发生组分的疾病（功能失调的TOM和TIM蛋白），（ii）由转运代谢物的功能失调载体导致的线粒体代谢疾病，以及（iii）由参与ATP产生的功能失调载体导致的线粒体氧化磷酸化疾病。这些通路的失调会导致严重的病理状况，具体病理取决于受影响途径和组织。下面我们讨论TOM和TIM22亚基中致病的突变，并以Citrin缺陷症和SLC25A13突变作为案例研究加以重点说明。
3.1 遗传性线粒体病与TOM复合体
TOM复合体的功能障碍正成为线粒体病病理学的贡献因素之一，受体蛋白TOMM7和TOMM70已被发现与遗传性线粒体病相关。在TOMM7基因中发现的纯合突变与Garg-Mishra早衰样综合征和伴有烟雾病的微头骨发育不良性侏儒症（MOPD-II）相关。尽管对患有相同TOMM7P29L突变的患者进行了检查，但两项研究报告了相反的细胞表型。此外，最近在TOMM7基因的内含子中发现了一个剪接变异，其临床后果严重，症状提示Leigh综合征和视神经萎缩。
在TOMM70基因C端发现的de novo错义突变已在两名患者中描述，其共同的表型表现为白质异常、肌张力低下、共济失调、肌张力障碍和反射亢进。此外，还发现一名患者具有TOMM70复合杂合突变，导致严重贫血、乳酸性酸中毒和发育迟缓。在永生化患者淋巴细胞中，TOMM70与TOM复合体的结合稳定性降低，并且细胞色素c氧化酶（Complex IV）的蛋白水平和活性均降低，通过重新表达野生型TOMM70可挽救此缺陷，但患者突变体则不能。TOMM7和TOMM70的突变表明了线粒体主要入口功能丧失的严重后果，突显了TOM复合体在人类健康中不可或缺且不可替代的作用。
3.2 遗传性线粒体病与TIM22复合体
在一名患有杂合TIMM22突变的患者中，导致TIMM22无义和错义突变，临床表现为胃食管反流病、肌张力低下、乳酸升高、白质髓鞘形成延迟和线粒体功能障碍，诊断为联合氧化磷酸化缺陷症43型。患者成纤维细胞显示TIMM22蛋白和TIM22复合体水平降低，同时TIM22底物水平也降低，表明功能性TIM22复合体缺失。
Sengers综合征是一种常染色体隐性遗传的线粒体疾病，主要由TIM22亚基AGK的突变引起。尽管记录的患者表型存在差异，但患者主要有三种物理表型：白内障、心脏和骨骼肌的线粒体肌病以及乳酸性酸中毒。对患者细胞和AGK敲除细胞的生化分析显示，代谢物载体蛋白输入减少、脂质生物合成受损以及TIM22复合体稳定性降低。此外，在17名Sengers综合征患者中均发现了TIMM29的致病性变异，所有患者均为Trp172高度保守残基的错义突变的纯合子，并表现为该病的严重形式。这些研究共同证实了Sengers综合征的病因是TIM22复合体蛋白的缺陷。
4 SLC蛋白的遗传性疾病：聚焦Citrin缺陷症
迄今为止，已在22种不同的线粒体载体中发现了致病突变，导致罕见的代谢疾病，突显了它们在人类健康中的重要作用。与线粒体载体蛋白相关的大多数疾病似乎是常染色体隐性遗传，但由编码ADP/ATP转运蛋白（ANT1）的SLC25A4基因突变引起的常染色体显性进行性眼外肌麻痹（PEOA2）除外。病理表现取决于受影响的代谢途径和受影响蛋白的组织表达谱。线粒体载体蛋白的突变经常发生在影响蛋白质生物发生、活性或结构的保守区域。对18种线粒体载体的疾病相关错义突变的比较表明，45%的突变位于底物易位孔，表明这是一个极易发生突变的区域。尽管在线粒体载体中发现的致病突变越来越多，但对突变蛋白的生化表征仍然缺乏，导致对驱动发病机制和疾病进展的机制理解不完整。
