《The Veterinary Journal》：Duplex Real-Time qPCR Assay Targeting β-Tubulin SNPs for Detection of Albendazole Resistance in
Haemonchus contortus
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本研究开发了一种双plex实时定量PCR方法，针对隐狍圭虫β-微管基因198和200位点的SNP，可有效区分敏感、耐药及混合感染样本，为耐药监测提供工具。
陈新迪|张莉莉|王腾宇|张浩|王瑞|卢静|高娃|王文龙|刘春霞
中国内蒙古自治区农业大学兽医学院动物疾病临床诊断与治疗技术重点实验室，呼和浩特市，010018
摘要
Haemonchus contortus（H. contortus）是一种主要的胃肠道寄生线虫，对全球反刍动物构成威胁，该线虫表现出对阿苯达唑的耐药性，这种耐药性主要与β-微管蛋白I型基因特定密码子的单核苷酸多态性（SNPs）有关，尤其是在密码子167（F167Y）、198（E198A）和200（F200Y）处。在中国，耐药菌株中最常检测到的是密码子198和200的突变。为了实现快速准确的耐药性检测，本研究旨在开发一种针对β-微管蛋白基因198和200位点SNPs的双链实时定量PCR（duplex qPCR）检测方法，以精确区分H. contortus的阿苯达唑耐药性。设计了针对β-微管蛋白I型基因198和200位点的特异性引物和TaqMan探针，建立了单链和双链qPCR检测体系。单链qPCR的检测限分别为：敏感型为1 × 101拷贝/μL，198耐药型为1 × 101拷贝/μL，200耐药型也为1 × 101拷贝/μL，具有高特异性和良好的重复性（批内变异系数（CV）< 0.72%，批间CV < 0.77%）。在此基础上，优化了双链qPCR方法，敏感型的检测限为1 × 103拷贝/μL，耐药型的检测限为1 × 101拷贝/μL，批内和批间CV均< 0.55%。该方法有效区分了敏感型、耐药型和混合感染样本。应用于102个临床样本后，发现1个敏感型、25个耐药型和76个混合感染病例。对7个随机选取的样本进行测序，结果与qPCR结果一致，进一步证实了该检测方法的敏感性和准确性。本研究成功建立了一种快速、敏感且特异的双链qPCR方法，能够准确区分H. contortus的阿苯达唑耐药基因型，为兽医临床实践中的抗虫药物选择和耐药性监测提供了有效工具。
引言
Haemonchus contortus是一种常见的胃肠道线虫，主要寄生于反刍动物的皱胃中，偶尔也会寄生于小肠（Nazish等，2021；Wondimu等，2025）。它可导致宿主贫血、营养不良甚至死亡，给畜牧业带来重大经济损失（Chen等，2024；Gasser等，2016；Nagy等，2016）。由于其对宿主健康的严重影响，H. contortus受到了广泛关注，而抗虫药物耐药性（AR）已成为全球性挑战（Babják等，2018；Crook等，2016；Muchiut等，2018）。抗虫药物耐药性是指寄生虫对药物的可感性遗传性丧失或降低，使得原本有效的药物剂量无法对其产生效果。也可以描述为当暴露于初次治疗时使用的相同药物剂量时，受感染寄生虫的比例下降，表明药物效果减弱（Ahuir-Baraja等，2021；Charlier等，2022）。H. contortus的控制主要依赖于广谱抗虫药物，其中苯并咪唑类（如阿苯达唑）、咪唑噻唑类（如左旋咪唑）和大环内酯类（如伊维菌素）被广泛使用（Byaruhanga和Okwee-Acai，2013；Luque等，2021；Rodrigues等，2025）。此外，一些新型药物如氨基乙腈衍生物（如莫内潘特尔）也在某些地区用于控制这种寄生虫（Niciura等，2019；Van den Brom等，2015）。然而，这些药物的频繁和不当使用加速了耐药性的产生和传播，现在全球许多地区都存在耐药性问题（Babják等，2023；Springer等，2022；Tuerhong等，2024）。
阿苯达唑的作用机制是结合线虫中的β-微管蛋白（Nayak等，2011）。微管是许多细胞器的关键组成部分，在细胞分裂和细胞内运输中起重要作用。阿苯达唑与β-微管蛋白结合，阻止其聚合，从而破坏微管形成，影响有丝分裂和能量依赖性等正常细胞过程（Barrère等，2012；Movahedi等，2017）。先前的研究表明，阿苯达唑耐药性与β-微管蛋白I型基因中的SNPs密切相关，特别是F200Y（TTC→TAC）、E198A（GAA→GCA）和F167Y（TTC→TAC）（Santos等，2017）。在中国，耐药菌株中经常检测到密码子198和200的突变，而F167Y突变较为罕见（Shen等，2019；Tuerhong等，2025）。
常用的H. contortus耐药性检测方法包括粪便虫卵计数减少试验（FECRT）和虫卵孵化试验（EHA）（Coles等，1992；Kotze和Prichard，2016；Levecke等，2012）。然而，这些表型方法存在局限性，无法在临床症状出现之前检测到耐药性，也无法识别特定的耐药相关突变。此外，这些方法的灵敏度相对较低，且需要复杂的虫卵分离和培养技术。相比之下，分子技术克服了这些缺点，可以实现体内和体外检测。尽管qPCR的DNA提取也需要虫卵分离，因此与体外检测方法有一些共同步骤，但qPCR仍是一种理想的分子诊断工具，因为它具有高灵敏度、强特异性，并能检测特定的耐药相关突变（Lau等，2024；Meng等，2025；Zoccola等，2017）。
基于此，本研究针对β-微管蛋白I型基因的198和200位点设计了特异性引物和TaqMan探针，并标准化和验证了单链和双链qPCR检测方法，用于检测H. contortus的阿苯达唑耐药性。进一步使用临床样本对这些方法进行了评估，以确保其适用于耐药性监测和基于证据的抗虫药物选择。
样本收集
从内蒙古自治区农业大学兽医学院的寄生虫学实验室获得了H. contortus 198耐药株（198?R）的基因组DNA，以及Nematodirus filicollis、绦虫、Cryptosporidium、Mycoplasma、Pasteurella、Streptococcus和Salmonella的DNA。这些非H. contortus的DNA样本用于评估qPCR检测方法的分析特异性。
引物和探针的筛选
qPCR反应条件的优化显示，前两组探针与设计的引物匹配良好，产生了典型的扩增曲线，而第三组探针未能产生可检测的扩增信号（图1）。根据扩增效率和曲线特征，选择了针对β-微管蛋白I型基因的引物和两个特定探针（探针1和探针2）用于后续实验。目标基因的扩增
对pUC-SS质粒进行了PCR扩增
讨论
Haemonchus contortus对阿苯达唑的耐药性日益严重（Domke等，2012；Howell等，2008；Waghorn等，2006），导致治疗效果不佳、动物生产力下降和死亡率升高（Sutherland和Leathwick，2011）。目前对Haemonchus抗虫药物耐药性的监测主要依赖于传统的表型方法（如EHA和FECRT）以及分子技术（如常规PCR）。然而，
结论
本研究证明，使用双链qPCR方法针对β-微管蛋白SNPs能够高效可靠地识别H. contortus的阿苯达唑耐药性。该方法能够同时区分敏感型、耐药型和混合基因型感染，为早期耐药性检测和大规模监测提供了明显优势。所建立的方法学框架突显了基于SNP的分子诊断在指导抗虫药物选择和耐药性监测方面的价值。
伦理批准和参与同意
所有实验均遵循相关指南和规定。所有动物实验的方案均获得了内蒙古自治区农业大学动物护理和使用伦理委员会的批准（许可代码：NND2023068）以及中华人民共和国的动物伦理指南，所有方法严格遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南2.0的要求。在实验前已获得动物所有者的知情同意
资金支持
本研究得到了内蒙古自治区直属高校基础科学研究业务经费项目——内蒙古自治区农业大学跨学科研究基金（项目编号：BR231406）、内蒙古自治区直属高校基础科学研究业务经费项目——科技创新团队建设专项（B类项目，项目编号：BR251303）以及国家
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卢静：撰写——审稿与编辑，资料整理。高娃：撰写——审稿与编辑，资料整理。张浩：撰写——审稿与编辑，资料整理，实验设计。王瑞：撰写——审稿与编辑，资料整理。张莉莉：撰写——审稿与编辑，软件使用，方法学设计，数据分析。王腾宇：撰写——审稿与编辑，验证，方法学设计，实验设计。陈新迪：撰写——初稿撰写，软件使用，方法学设计，实验设计，数据分析。王文龙：撰写——审稿与CRediT作者贡献声明
Jing Lu：撰写——审稿与编辑，资料整理。高娃：撰写——审稿与编辑，资料整理。张浩：撰写——审稿与编辑，资料整理，实验设计。王瑞：撰写——审稿与编辑，资料整理，数据分析。张莉莉：撰写——审稿与编辑，软件使用，方法学设计，数据分析。王腾宇：撰写——审稿与编辑，验证，方法学设计，实验设计。陈新迪：撰写——初稿撰写，软件使用，方法学设计，数据分析，实验设计。王文龙：撰写——审稿与生成式AI和AI辅助技术在写作过程中的使用声明
在准备本研究过程中，作者使用了ChatGPT、DeepL和Grammarly来改进语言和可读性。使用这些工具后，作者对内容进行了必要的审查和编辑，并对发表文章的内容负全责。利益冲突声明
作者声明没有受到任何竞争性财务利益或个人关系的影响。致谢
我们感谢内蒙古自治区农业大学兽医学院的寄生虫研究团队。不适用。作者声明没有受到任何竞争性财务利益或个人关系的影响。
