综述：用于研究戊型肝炎病毒感染的体外培养系统的演变

《Virology》：The evolution of in vitro culture systems for the study of hepatitis E virus infection

HEV体外模型研究进展：从肝细胞系到多器官平台，揭示病毒复制机制与跨组织传播潜力，强调复杂模型在解析肝内外病理表现中的应用价值，提出整合微流控技术与多组学分析的未来方向。

Hannah M. Brown|Xiang-Jin Meng

弗吉尼亚理工大学暨州立大学弗吉尼亚-马里兰兽医学院生物医学科学与病理生物学系，布莱克斯堡，VA 24061

摘要

戊型肝炎病毒（HEV）是全球急性病毒性肝炎的主要原因之一，越来越多地被认为是一种重要的动物源性病原体，能够引起慢性感染和多种肝外表现。然而，由于缺乏强大且可重复的体外培养系统，对HEV的生物学和发病机制的理解一直受到限制。早期的研究主要依赖于肝癌细胞系，这些细胞系虽然实验操作方便，但往往无法有效支持病毒复制，也不能完全反映肝脏的生理功能。最近，细胞培养方法的重大进展扩大了可用于研究HEV的模型范围。本文对目前用于研究HEV感染的体外培养系统进行了全面回顾，重点探讨了生理复杂性的提高如何有助于更深入地了解病毒复制、宿主嗜性及发病机制。我们讨论了基于肝癌细胞的经典系统以及更先进的肝脏模型，包括干细胞衍生的培养物和类器官。此外，还介绍了肝外和生理屏障模型（如体外胎盘和血脑屏障系统），这些模型为研究HEV相关的肝外疾病提供了新的机会。在整个过程中，我们强调了不同培养系统中先天免疫能力、细胞分化状态和感染方式的差异如何影响实验结果。最后，我们指出了该领域存在的不足及未来研究方向，包括整合微流控多器官平台、改进的类器官共培养系统以及多组学方法。这些进展旨在弥合简单细胞培养模型与人类疾病之间的差距，为研究HEV感染动态提供更有力的工具。

引言

戊型肝炎病毒（HEV）是全球急性病毒性肝炎的主要原因，每年导致约2000万例感染，其中330万例有症状，报告的死亡病例为44,000例¹。HEV属于HEpeviridae家族，该家族进一步分为Orthohepevirinae和Parahepevirinae两个亚科²。大多数感染人类的HEV株属于Paslahepevirus属的Paslahepevirus balayani物种，该物种至少包含8种不同的基因型（HEV-1至HEV-8）³（图1）。Paslahepevirus属的一个显著特点是其宿主范围广泛，与其他Orthohepevirinae亚科成员相比，而HEV是一种公认的重要动物源性病毒⁴。根据世界卫生组织（WHO）和联合国粮食及农业组织（FAO）联合专家组的最新报告，HEV在887种可能从动物传播给人类的病毒中位列第六位⁵，同时也是重要的食源性疾病病毒之一⁶，这凸显了其在公共卫生和食品安全方面的重要性。

HEV-1和HEV-2仅感染人类，没有动物源性感染的报道⁷。这些基因型主要分布在非洲、亚洲、印度次大陆和中东等发展中国家⁸，这些地区的传播途径主要是水源受到粪便污染⁸。相比之下，HEV-3和HEV-4具有动物源性，可以感染人类和其他多种动物，并在欧洲、北美和新西兰等工业化国家广泛存在^{9, 10, 11, 14}。HEV-3传播给人类的主要途径是食用未煮熟的动物肉类（如猪肉产品），屠宰场中约有6%的猪仍然携带病毒^{15, 16, 17}。其他传播途径还包括输血或器官移植^{18, 19}、兽医²⁰、屠夫²¹和农场或屠宰场工人^{22, 23}的职业暴露，以及食用受污染的海鲜和农产品²⁴。表1总结了四种主要感染人类的HEV基因型（HEV-1至HEV-4）的关键特征。

HEV-5和HEV-6仅在野猪中被发现，尚未有感染人类的病例报道^{25, 26, 27}。然而，已有实验证明这两种基因型可以感染人类细胞系，表明它们具有动物源性潜力^{25, 28}。HEV-7和HEV-8在中东²⁹和中国³⁰的骆驼中被发现。值得注意的是，有一例人类感染HEV-7的病例，与食用骆驼肉和奶有关³¹。

除了HEV-1至HEV-4之外，另一种已知感染人类的HEV株是Rocahepevirus属中的HEV-C1^{32, 33}。迄今为止，已有超过34例人类感染Rocahepevirus的病例报告³⁴，这表明这是一个潜在的新问题。

HEV是一种正链单链RNA病毒，基因组大小约为7.2 kb，包含三个开放阅读框（ORF）（图2）。ORF1编码一种非结构多蛋白，直接从病毒基因组翻译而来³⁵，其中包含几个可能与病毒复制相关的功能域，但其翻译后加工的详细机制尚未明确36³⁷。ORF2产生病毒衣壳蛋白和其他通过替代翻译途径产生的分泌性蛋白，这些蛋白被认为与免疫调节有关38, 39^{40, 41, 42}。值得注意的是，HEV-1独特地含有ORF4，据报道该蛋白在应激条件下可增强病毒复制^{43, 44}。

在受感染的宿主体内观察到两种形式的HEV病毒颗粒，反映了病毒生命周期的不同阶段⁴⁵。在血液中，HEV以准包膜病毒颗粒的形式存在，具有宿主来源的外膜⁴⁶；而在粪便中则存在无包膜病毒颗粒，这种形式促进了粪-口传播循环⁴⁵。尽管认为肠道感染先于肝脏感染和复制，但病毒从胃肠道转移到肝脏的机制尚未完全明了。尽管进行了大量研究，至今尚未确定特定的病毒附着和进入受体。多项研究表明，多种宿主因素（如肝素硫酸蛋白聚糖⁴⁷、表皮生长因子受体⁴⁸和网格蛋白介导的内吞途径⁴⁹）会影响病毒的附着和进入，这表明HEV可能利用了保守的细胞过程，而不仅仅是单一的病毒特异性受体。

虽然HEV感染通常是无症状或自限性的，但越来越多的临床表现表明它具有全身性和肝外影响。在感染HEV-1的孕妇中，高达30%会出现不良妊娠结局⁵⁰，HEV感染还与多种神经系统并发症相关，包括神经性肌萎缩^{51, 52}、吉兰-巴雷综合征⁵³和贝尔氏面瘫⁵⁴。此外，在免疫功能低下的个体中，尤其是感染动物源性HEV-3的情况下，还报道了病毒持续存在和慢性HEV感染⁹。HEV发病率的上升、感染者出现的肝外表现以及该病毒的动物源性特征，使其成为日益严重的公共卫生问题。

HEV在细胞培养系统中难以繁殖。尽管经过数十年的研究，其传播机制和组织特异性发病机制仍不清楚，这凸显了传统肝脏单培养系统的局限性。目前针对HEV感染的治疗选择有限，因为没有针对HEV的特异性抗病毒药物。临床主要使用利巴韦林和聚乙二醇化干扰素，但这些药物常常伴有严重的副作用和治疗失败⁵⁵

节选

肝癌细胞系

HEV研究中长期存在的一个挑战是缺乏一个被广泛接受、强大且可重复的体外培养系统。自HEV被发现以来，实验工作主要依赖于连续的肿瘤来源的肝细胞系，这些细胞系仍然是研究HEV复制和宿主-病原体相互作用的最常用模型。连续细胞系易于操作、高度可重复且可商业购买^{56, 57}。尽管它们非常有用，

先进的肝脏培养模型

基于连续细胞系的研究成果，研究人员越来越注重提高肝脏培养模型的复杂性，以更准确地模拟肝脏的生理功能和HEV复制过程。这些模型从原代肝细胞培养到三维（3D）肝脏类器官和微生理系统不等，为研究HEV感染和复制动态提供了更好的平台

肝外和生理屏障模型

近年来，研究人员生成了越来越复杂的多种组织类型模型，从而能够在更合适的模型中研究HEV在肝外的感染情况。虽然肝脏仍然是HEV复制的主要场所，但越来越多的临床和实验证据表明，HEV可以进入并在多种肝外组织中复制。许多严重的或非典型的HEV感染表现，包括神经系统症状

未来展望和新兴平台

历史上，体外HEV培养一直受到模型产量低且结果不一致的挑战，不同病毒分离株、基因型、相同组织来源的细胞系以及不同研究小组之间的结果存在差异。因此，大量研究致力于在HEV的自然肝脏环境中模拟其感染过程，从而显著提高了我们对这种病毒的理解。然而，随着肝外疾病临床表现的临床相关性日益受到重视

CRediT作者贡献声明

Hannah M. Brown：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、方法学设计、实验设计、数据分析、概念构建。Xiang-Jin Meng：撰写——审稿与编辑、监督、资源协调、概念构建

未引用参考文献

50.; 91.; 148.; 149.; 150.; 152.; 157.; 158.

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

? 作者是该期刊的编委会成员/主编/副主编/特邀编辑，未参与本文的审稿或发表决定。

致谢

作者关于戊型肝炎病毒的研究得到了美国国家科学基金会（award number: 2412389）和美国国立卫生研究院（award number: R37AI179614）的资助。