《Virology》：A genetically stable GFP reporter virus platform for contemporary Chinese PRRSV-1 and its use in fluorescence neutralization testing
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中国流行猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒1型（PRRSV-1）GXFS20220129株的反向遗传学平台及GFP报告病毒构建。通过全长感染性cDNA克隆拯救获得复制缺陷型病毒rGXFS/F3/ic，其生长动力学与原始毒株相似但稍弱。通过异源PRRSV-2 TRS6元件插入ORF1b-ORF2边界，成功获得高表达的GFP重组病毒rGXFS-GFP，该病毒在连续传代10代后仍保持遗传稳定性，并可用于荧光中和抗体检测。该平台为PRRSV-1研究提供了重要工具。
陈一婷|王新东|刘凯毅|龙建明|陈康宁|王国伟|苏志英|李国阳|任同伟|秦一峰|欧阳康|陈颖|黄伟健|尹叶石|魏祖章
中国广西大学动物科学与技术学院动物传染病与分子免疫学实验室，南宁，530005
摘要
系统发育上多样的猪繁殖与呼吸综合征病毒1型（PRRSV-1）毒株在中国迅速传播，这需要针对当前分离株开发先进的研究工具。为了解决这类资源的稀缺问题，我们为常见的中国PRRSV-1毒株GXFS20220129开发了一个反向遗传学平台。我们构建了一个全长 infectious cDNA 克隆，并用它来恢复具有复制能力的病毒（rGXFS/F3/ic）。其生长动力学虽然比亲本毒株略有减弱，但总体生长模式保持一致。利用该系统，我们生成了表达绿色荧光蛋白（GFP）的重组报告病毒，这些病毒由来自同源 PRRSV-1 或异源 PRRSV-2 的转录调控序列（TRS）驱动，该序列被插入到 ORF1b-ORF2 结合处。含有异源 PRRSV-2 TRS6 元素的病毒表现出更强的 GFP 和病毒蛋白表达，表明其转录活性增强。这种优化的报告病毒（命名为 rGXFS-GFP）表现出稳定的复制动力学和斑块形态，与亲本克隆相似，并且在连续十次传代后仍保持遗传稳定性。此外，rGXFS-GFP 成功应用于基于荧光的病毒中和试验中，为中和抗体的检测提供了直接和定量的结果。本研究为一种流行的 PRRSV-1 毒株建立了一个重要的反向遗传学和报告病毒系统，为加速病毒生物学、疫苗效力以及针对这一新兴威胁的抗病毒策略的研究提供了强大的工具。
引言
猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的，它仍然是全球养猪业最具经济影响的疾病之一。PRRS 的临床表现包括母猪严重的繁殖失败和仔猪的呼吸窘迫，导致巨大的生产损失（Mengeling 等，1998；Neumann 等，2005）。PRRSV 是一种有包膜的正链单链 RNA 病毒，属于动脉病毒科（Arteriviridae）（Ruedas-Torres 等，2021）。根据其遗传多样性，PRRSV 被分为两个不同的物种：Betaarterivirus suid 1（PRRSV-1）和 Betaarterivirus suid 2（PRRSV-2）（Frossard 等，2012）。PRRSV 基因组大约包含 15,000 个核苷酸，包含至少十个开放阅读框（ORF），这些阅读框两侧是非翻译区（UTRs）和一个 3′ poly(A) 尾部（Dai 等，2020）。ORF1a 和 ORF1b 编码复制酶多聚蛋白（非结构蛋白），而 ORF2 到 ORF7 编码结构蛋白（Zimmerman 等，1997；Dokland，2010）。
虽然历史上 PRRSV-2 是中国的主要基因型，并且一直是大量研究的焦点，但近年来 PRRSV-1 在中国多个地区迅速传播，现在至少在 22 个省份有高流行率（Li 等，2022；Yu 等，2022；Cai 等，2023）。最近的研究记录了多种 PRRSV-1 毒株的持续出现和传播，反映了病毒在中国猪群中的活跃进化和适应（Qiu 等，2025；Sun 等，2023）。这些当代毒株通常表现出不同的致病特性，包括增强的毒力和可变的组织嗜性，给疾病控制带来了新的挑战（Wang 等，2023）。PRRSV-1 流行率的增加和致病多样性的增强凸显了它对中国养猪业的日益严重的威胁，并强调了开发针对当前流行毒株的研究工具的迫切需求（Wang 等，2016；Li 等，2023）。
在动脉病毒科（Arteriviridae）建立之后，马动脉炎病毒（EAV）和 PRRSV 是最早开发出反向遗传学系统的病毒之一（Meulenberg 等，1998a；Van Dinten 等，1997）。反向遗传学使得能够精确操作病毒基因组，从而为病毒 RNA 和蛋白质的结构-功能研究、病毒致病性研究、宿主免疫反应以及减毒活疫苗候选物的合理设计提供了基础（Snijder 等，2013）。尽管已经有许多针对 PRRSV-2 的感染性克隆揭示了病毒蛋白或调控元件与生物表型之间的紧密关联（Chaudhari 和 Vu，2020a），但针对 PRRSV-1 的感染性克隆相对较少，限制了对 PRRSV-1 特异性生物学的深入研究，特别是针对目前在中国流行的毒株（Fang 等，2006）。因此，基于当前流行 PRRSV-1 分离株的反向遗传学平台和报告病毒系统仍然很稀缺。从当前流行的 PRRSV-1 毒株中开发报告病毒对于研究病毒生物学和在实地相关条件下评估疫苗诱导的免疫力非常重要。
表达绿色荧光蛋白（GFP）的报告病毒已被证明对于实时监测感染、高通量抗病毒筛选和病毒中和试验非常有用（Cai 等，2023；Pei 等，2009）。由于基因组大小的限制和亚基因组 mRNA 转录的复杂调控，构建遗传稳定的 PRRSV-1 报告病毒仍然具有挑战性（Dai 等，2020）。在 PRRSV 中，转录调控序列（TRSs）对于亚基因组 RNA 的合成至关重要，核心 TRS 动机内的变异会显著影响下游基因表达（Zhang 等，2025）。异源 TRS 元素对 PRRSV-1 背景下的报告基因表达的影响尚未完全阐明。
在这项研究中，我们构建了当前中国 PRRSV-1 毒株 GXFS20220129 的全长 infectious cDNA 克隆，该毒株是在我们的实验室分离的。基于全基因组序列的系统发育分析显示，GXFS20220129 属于欧洲基因型（PRRSV-1）亚型 1 毒株，并且与中国最近分离的其他 PRRSV-1 毒株有遗传关系。它可能是欧洲原型毒株 Lelystad 病毒亚型 1 的一个变体。GXFS20220129 的遗传和生物学特性之前已有描述（Liu 等，2025），并且已在细胞培养中恢复了感染性病毒。我们进一步工程化了在 ORF1b-ORF2 结合处插入了天然 PRRSV-1 或异源 PRRSV-2 TRS6 元件的重组 PRRSV-1 报告病毒，这些病毒表达 GFP。这些构建体在体外复制特性、报告基因表达水平和遗传稳定性方面进行了系统比较。随后，优化后的 GFP 报告病毒被评估用于基于荧光的中和试验。总的来说，我们的发现为当前 PRRSV-1 毒株建立了一个强大的反向遗传学平台，并提供了一个遗传稳定的报告病毒，以支持对其生物学、疫苗评估和抗病毒发现的紧急研究，特别是在其在中国流行率不断上升的背景下。
章节片段
细胞和病毒
本研究使用了 MARC-pCD163 细胞系，该细胞系是经过改造的 MARC-145 细胞系，能够表达猪 CD163（Jing 等，2022）。MARC-pCD163 和 Baby Hamster Kidney 细胞（BHK-21 细胞）都在含有 10% 胎牛血清（FBS）的 Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）中培养，温度为 37°C，培养环境为含有 5% CO2 的湿润气氛。BHK-21 细胞用于通过转染来恢复病毒。后续的病毒传代和实验均在其中进行
全长感染性克隆的构建与恢复
通过将七个重叠的 RT-PCR 片段组装到一个基于 pBluescript 的质粒载体中，生成了 PRRSV-1 毒株 GXFS20220129（第 3 代）的全长 infectious cDNA 克隆，如图 1A 所示。最终构建体被命名为 pGXFS/F3/ic，包含巨细胞病毒（CMV）立即早期启动子、完整的病毒基因组、合成的 3′ poly(A) 区和下游的转录调控元件。克隆的完整性和序列准确性已经得到验证
讨论
在这项研究中，我们构建了当前中国 PRRSV-1 毒株 GXFS20220129 的全长 infectious cDNA 克隆，并随后衍生出了一个表达 GFP 的重组报告病毒，该病毒具有很高的遗传稳定性。这个系统为快速检测中和抗体和进行 PRRSV-1 的功能基因组研究提供了一个多功能的平台，而 PRRSV 是在中国越来越重要的病毒。从细菌培养物中成功恢复了具有复制能力的病毒（rGXFS/F3/ic）
结论
总之，我们为 PRRSV-1 建立了一个强大的反向遗传学平台，并生成了一个相应的 GFP 报告病毒 rGXFS-GFP，该病毒表现出与亲本病毒相似的遗传稳定性和复制动力学。这种报告病毒作为基于荧光的中和试验的强大工具，其中 GFP 阳性焦点的定量提供了中和抗体滴度的有效估计。rGXFS-GFP 构建体是一个有价值的实验工具
资助
本项工作得到了 国家自然科学基金（批准号：32370345 和 32172889）和 广西自然科学基金（2018GXNSFDA281021）的资助。
CRediT 作者贡献声明
陈一婷：概念构思、数据整理、正式分析、研究、方法论、撰写——初稿。王新东：概念构思、数据整理、正式分析、研究、方法论、撰写——初稿。刘凯毅：数据整理、正式分析、研究、方法论。龙建明：数据整理、正式分析。陈康宁：数据整理、正式分析。王国伟：数据整理、正式分析。苏志英：撰写——审阅与编辑。李国阳：
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
