假尿苷合成酶Trub1介导的RNA修饰在免疫细胞稳态与功能中非必需的发现

《Genes & Immunity》：Trub1-mediated pseudouridylation is dispensable for immune cell development and homeostasis

这项研究针对假尿苷合成酶Trub1在免疫系统中的作用尚不清楚的问题，通过构建条件性和全身性Trub1缺陷小鼠模型，结合混合骨髓嵌合体和高参数流式细胞术，系统探究了Trub1介导的假尿苷修饰在T细胞、B细胞、NK细胞及髓系细胞发育、稳态及功能分化（如流感抗病毒反应和MC38肿瘤免疫应答）中的作用。结果表明，尽管Trub1负责线粒体tRNAΨ55的修饰，但其缺失在稳态或疾病状态下均未对多种免疫细胞产生显著影响。这提示Trub1在mRNA假尿苷化中的作用可能被高估，或存在其他假尿苷合成酶（PUS）的补偿机制，为理解RNA修饰在免疫系统中的功能冗余性提供了新视角。

　　

在我们的身体里，免疫细胞如同忠诚的卫士，时刻警惕并清除入侵的病原体。它们的快速反应和功能分化依赖于精密的分子调控网络。近年来，一类被称为“RNA修饰”的分子标记，如同写在RNA上的“密码”，被发现在调控基因表达和细胞命运中扮演关键角色。其中，m⁶A（N6-甲基腺苷）RNA甲基化已被证实能调控T细胞、树突状细胞等多种免疫细胞的激活。然而，另一种同样普遍存在于mRNA等RNA中的修饰——假尿苷化，其在免疫系统中的作用却鲜为人知。假尿苷化能够提高RNA稳定性、促进碱基堆积和翻译保真度，听起来像是一个重要的调控开关。在众多假尿苷合成酶中，Trub1（假尿苷合成酶1）被认为与PUS7共同负责哺乳动物mRNA中大部分假尿苷的安装，并且也被报道能修饰tRNA。那么，一个自然而然的问题是：这个看似重要的“编辑”Trub1，是否也是免疫细胞发育、维持稳态或发挥功能所必需的“幕后导演”呢？为了解开这个谜题，一组研究人员在《Genes & Immunity》上发表了一项深入研究。

研究者们运用了多种关键技术方法来系统回答上述问题。首先，他们通过生物信息学分析了公共数据库（immgen.org）中Trub1在不同免疫细胞亚群的表达谱。其次，他们构建了条件性（T细胞特异性、T_reg特异性）和全身性Trub1基因敲除小鼠模型。核心的实验手段包括建立体内竞争性实验模型——混合骨髓嵌合体，即将Trub1缺陷型与野生型小鼠的骨髓按比例混合后移植给致死性辐照的小鼠，以在体内直接比较Trub1缺失细胞的竞争性适应度。此外，研究广泛采用了高参数流式细胞术，对稳态、流感病毒感染（H3N2病毒株）以及MC38结肠腺癌皮下肿瘤模型等多种情境下的免疫细胞进行了全面的表型和功能分析。同时，他们也通过RT-qPCR、Western Blot和HydraPsiSeq（一种定量检测假尿苷的技术）验证了敲除效率并确定了Trub1的底物。

正常发育和T_reg的体外功能不依赖于Trub1

研究人员发现，尽管公共数据显示结肠（富含外周诱导性T_reg， pT_reg）与脾脏（富含胸腺来源性T_reg， tT_reg）的T_reg中Trub1表达有差异，但利用Foxp3^Cre小鼠构建的T_reg特异性Trub1敲除小鼠（Trub1^Foxp3-KO）显示，Trub1缺失并不影响体外诱导T_reg的效率，也不损害T_reg在体外抑制常规T细胞增殖的能力。在混合骨髓嵌合体实验中，Trub1缺陷的T_reg与野生型T_reg相比，在竞争性重建、表面标志物（如CD25, CTLA-4）、转录因子（如GATA-3, Helios）及细胞因子（如IL-10, TGF-β）表达上均无显著差异，表明Trub1介导的假尿苷化对于T_reg的稳态和功能是可有可无的。

Trub1缺失时T细胞的正常发育和分化

尽管Trub1在T细胞不同发育阶段（从双阴性胸腺细胞到活化的脾脏T细胞）动态表达，但利用CD4^Cre小鼠构建的T细胞特异性Trub1敲除小鼠（Trub1^Tcell-KO）显示，Trub1缺失并不影响初始CD4 T细胞在体外向T_H1、T_H2、T_H17亚群分化的能力。在混合骨髓嵌合体实验中，Trub1缺陷的CD4和CD8 T细胞在初始、活化、中央记忆亚群的频率，以及众多激活、功能相关标志物和细胞因子的表达上，与野生型细胞无异。这表明Trub1对于T细胞的发育、稳态和竞争适应度并非必需。

Trub1介导线粒体tRNA的特异性假尿苷化

一个意外的发现来自于Foxp3^Cre小鼠的“泄漏性”重组活动，偶然产生了全身性Trub1敲除小鼠（Trub1^All-KO）。通过HydraPsiSeq分析，研究人员证实了Trub1的缺失，并首次在小鼠中鉴定出Trub1负责7种线粒体tRNA（tRNA^Leu， tRNA^Gln， tRNA^Asn， tRNA^Ile， tRNA^Met， tRNA^Ser和 tRNA^Tyr）中高度保守的Ψ55位点的假尿苷化。这与之前报道的人源TRUB1功能部分一致，但并未在小鼠细胞质tRNA中观察到Ψ55的变化，提示可能存在物种特异性或与其他合成酶（如PUS10）的功能冗余。

Trub1缺失允许B细胞和髓系细胞正常发育

在Trub1^All-KO小鼠及其混合骨髓嵌合体中，研究人员评估了B细胞和各类髓系细胞（包括常规树突状细胞cDC、NK细胞、单核细胞、中性粒细胞等）的发育。结果显示，Trub1的缺失并未影响这些细胞在脾脏、淋巴结和派伊尔结中的频率，也未改变CD19⁺B细胞和CD11b⁺髓系细胞的细胞因子产生能力。这表明Trub1在免疫细胞发育和稳态中缺乏关键的调节功能。

Trub1缺失不损害流感感染中的T细胞介导的抗病毒反应

为了在免疫挑战情境下检验Trub1的作用，研究人员用流感病毒（H3N2）感染了Trub1^All-KO和Trub1^Tcell-KO小鼠。与野生型小鼠相比，Trub1缺陷小鼠在体重下降、临床评分和肺部病变（通过微型计算机断层扫描测量的非通气肺体积）方面均无显著差异。对支气管肺泡灌洗液和脾脏中浸润免疫细胞的高参数流式分析显示，Trub1缺失的CD8 T细胞、CD4 T_conv和T_reg在细胞数量、亚群分布、活化状态标志物（如CD69， PD-1）以及关键效应细胞因子（如IFN-γ， TNF-α）的产生上均未受损。这表明Trub1并不影响小鼠在流感感染中启动有效的抗病毒免疫应答。

Trub1缺失不影响MC38肿瘤模型中的抗肿瘤反应

在另一种免疫挑战模型——皮下接种MC38结肠癌细胞的实验中，Trub1^All-KO小鼠的肿瘤生长体积和终重量与野生型小鼠相当。对肿瘤浸润淋巴细胞、肿瘤引流淋巴结和非引流淋巴结的深入分析表明，Trub1缺失并未改变T_reg、CD4和CD8 T细胞各亚群的频率，也未影响这些细胞以及肿瘤内髓系细胞、NK细胞和B细胞上各种功能相关标志物的表达。因此，Trub1的缺失既未削弱也未增强针对MC38肿瘤的抗肿瘤免疫反应。

归纳研究结论与讨论

本研究通过一系列严谨的体内外实验，得出了一个与初始假设相悖的核心结论：假尿苷合成酶Trub1介导的RNA假尿苷化，对于免疫细胞（包括T细胞、B细胞、NK细胞和髓系细胞）在稳态下的发育、维持以及在流感感染、肿瘤生长等疾病状态下的功能性分化，都是“非必需的”。尽管研究确认了Trub1在小鼠线粒体tRNA特定位点假尿苷化中的确切作用，但这一生化功能的缺失并未转化为可观测的免疫表型缺陷。

这一“阴性结果”具有重要的科学意义。首先，它挑战了先前计算生物学研究可能高估Trub1在mRNA假尿苷化中作用的观点。其次，它强烈提示了假尿苷合成酶家族内部存在显著的功能冗余性。尽管假尿苷是一种广泛存在且进化保守的RNA修饰，Trub1也具有明确的底物识别序列，但其他PUS（如PUS7、PUS10）可能靶向相同的RNA分子或其他位点进行修饰，从而补偿了Trub1缺失造成的影响。这种冗余机制确保了关键生物学过程（如免疫细胞的快速应答和功能可塑性）的稳健性，不会因单个修饰酶的缺失而崩溃。

总之，这项研究将Trub1从免疫调控“必备玩家”的候选名单中移除，将研究焦点转向了假尿苷合成酶家族的集体功能与冗余机制。它提示未来需要研究Trub1与其他PUS（特别是PUS7和PUS10）的双重或多重缺失，才能更全面地揭示假尿苷化这一重要表观转录组学修饰在免疫系统及其他生理病理过程中的真实权重与调控网络。论文发表于《Genes & Immunity》，为理解RNA修饰的复杂性与生物学功能边界提供了关键数据。