《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Rationale for multi-epitope TGFβ vaccination in pancreatic cancer: evidence from immunologic and clinical correlates
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为解决胰腺导管腺癌对免疫检查点抑制剂（ICIs）等疗法抵抗性强、免疫抑制性肿瘤微环境（TME）是其主要障碍的难题，研究人员对TGFβ来源的多表位（TGFβ-15, -33, -38）的免疫原性和临床相关性进行了深入探索。研究结果发现，TGFβ-33在患者中可诱导强烈的T细胞反应，且基线TGFβ-33特异性T细胞频率较高与接受ICI联合放疗患者更好的总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）相关。更为重要的是，能对多个TGFβ表位产生基线反应的患者，生存期显著长于对单个或无反应的患者。研究团队还利用编码多个TGFβ表位的单一mRNA构建体，成功激活了针对不同TGFβ表位的特异性T细胞。这项研究为开发多表位TGFβ免疫调节疫苗（IMV）以增强PDAC抗肿瘤免疫、改善治疗反应提供了强有力的临床前依据，是转化免疫治疗领域的一个重要进展。
胰腺癌，尤其是胰腺导管腺癌（Pancreatic Ductal Adenocarcinoma, PDAC），长期以来被视为肿瘤治疗领域的“硬骨头”。其全球五年生存率不足10%，是预后最差的恶性肿瘤之一。除了发现晚、转移快之外，一个重要的原因是PDAC拥有一个“冷酷”的免疫抑制性肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）。在这个环境中，癌细胞和周围的免疫抑制细胞（如癌症相关成纤维细胞、调节性T细胞等）联手构筑了一道“铜墙铁壁”，使得能够识别并杀伤肿瘤的免疫细胞（特别是T细胞）难以进入并发挥作用。免疫检查点抑制剂（Immune Checkpoint Inhibitors, ICIs）虽然在许多肿瘤中取得了革命性成功，但面对PDAC这道壁垒，其疗效却相当有限。因此，如何“加热”这个“冷”肿瘤，重塑TME，成为治疗PDAC的关键突破口。
其中，转化生长因子-β（Transforming Growth Factor beta, TGFβ）被认为是维持这道免疫屏障的核心“建筑师”。它在PDAC的TME中大量存在，不仅直接促进纤维化、肿瘤生长和转移，更是抑制T细胞功能、导致“冷”免疫表型的元凶之一。既然直接阻断T细胞“刹车”（免疫检查点）效果不佳，科学家们开始思考一个新的策略：为什么不直接“策反”免疫系统，去攻击那些产生免疫抑制信号的细胞（如高表达TGFβ的细胞）呢？这催生了一种创新的治疗思路——免疫调节疫苗（Immune-Modulatory Vaccines, IMVs）。这类疫苗与传统以肿瘤抗原为靶点的疫苗不同，其目标是激活一类特殊的“反调节T细胞”，让它们去识别并清除TME中的免疫抑制细胞，从而瓦解免疫抑制的堡垒。其中，靶向TGFβ的IMV成为一个极具潜力的方向。
先前的研究已证实，单一TGFβ表位（如TGFβ-15）具有一定的免疫原性，并与患者较好的预后相关。然而，临床前小鼠模型提示，多表位疫苗在重塑TME、激发更强抗肿瘤免疫方面可能更具优势。为了验证这一策略在人体内的可行性，并为开发下一代TGFβ靶向疫苗提供坚实的理论基础，一项由R.E.J. Mortensen等人领导的团队开展了这项研究，相关成果发表在知名期刊《Signal Transduction and Targeted Therapy》上。
主要技术方法
研究主要应用了以下关键技术：
- 1.
体外T细胞功能分析：通过干扰素-γ酶联免疫斑点法（IFNγ ELISPOT）和细胞内细胞因子染色法（Intracellular Cytokine Staining, ICS），检测健康供体和PDAC患者外周血单个核细胞（PBMCs）对TGFβ来源多肽（TGFβ-15, -33, -38）的免疫反应，评估T细胞的表型（CD4+、CD8+）和功能。
- 2.
特异性T细胞扩增与识别实验：利用磁性激活细胞分选（MACS）、快速扩增方案（Rapid Expansion Protocol, REP）和有限稀释法，从体外培养物中富集和扩增TGFβ-33和TGFβ-38特异性T细胞。通过共培养实验，检测这些特异性T细胞对负载相关多肽的自体树突状细胞，以及内源性表达TGFβ的恶性髓系细胞系THP-1的识别能力。实验中使用了小干扰RNA（siRNA）敲低THP-1细胞的TGFβ表达，以证实识别的TGFβ依赖性。
- 3.
临床队列相关性分析：研究纳入了一项随机II期临床试验（CheckPAC, NCT02866383）中的PDAC患者队列，该队列患者接受了ICI（纳武利尤单抗±伊匹木单抗）联合立体定向体部放射治疗。通过分析患者基线（治疗前）和/或治疗中PBMCs的TGFβ特异性免疫反应，探究其与临床获益（部分缓解/疾病稳定 vs. 疾病进展）、总生存期（Overall Survival, OS）和无进展生存期（Progression-Free Survival, PFS）的相关性。
- 4.
mRNA疫苗平台验证：设计并构建了编码多个TGFβ表位（TGFβ-02, -15, -33, -38）的单链mRNA（TGFβ-ALL）。通过体外转录制备mRNA，电穿孔转染至自体树突状细胞，验证该mRNA能否被树突状细胞处理和呈递，并激活针对不同TGFβ表位的特异性T细胞。
研究结果
1. 健康供体和胰腺癌患者体内存在针对高免疫原性TGFβ来源T细胞表位的自发免疫
研究人员首先在31名健康供体和14名PDAC患者中检测了对TGFβ-15、TGFβ-33和TGFβ-38的T细胞反应。结果显示，三个表位在健康供体和患者中均能诱导IFNγ产生。值得注意的是，在患者队列中，TGFβ-33引发的反应频率和强度似乎更高。表型分析表明，这些反应主要由CD4+T细胞介导，但也观察到了少量TGFβ-33特异性的CD8+T细胞反应。
2. 健康供体和胰腺癌患者体内存在循环的TGFβ-33特异性记忆CD4+T细胞
为了探究TGFβ特异性T细胞是否在体内被激活并成为记忆库的一部分，研究人员从2名健康供体和2名PDAC患者中分离了CD4+CD45RO+记忆T细胞，并用负载TGFβ-33多肽的自体单核细胞进行刺激。结果成功检测到了强烈的TGFβ-33特异性反应，证实了TGFβ-33特异性记忆T细胞确实存在于健康个体和患者的外周循环中，且在患者来源的细胞中反应更强。
3. 基线对多种TGFβ来源表位的免疫力与胰腺癌患者的临床获益相关
接下来，研究团队评估了TGFβ特异性免疫反应的临床意义。他们分析了27名来自CheckPAC临床试验的PDAC患者。结果发现，在治疗开始时（基线）具有较高TGFβ-33特异性T细胞反应的患者，在后续接受ICI联合放疗后，获得了更好的临床获益（部分缓解或疾病稳定），并且其OS和PFS显著长于基线反应低于中位值的患者。更有趣的是，当将TGFβ-15的数据纳入分析时，发现基线时能对TGFβ-15和TGFβ-33两个表位都产生强反应（高于中位值）的患者，其OS和PFS显著优于对两个表位均无强反应或仅对其中一个有强反应的患者。这为多表位疫苗的优势提供了直接的临床证据。
4. TGFβ-33和TGFβ-38特异性T细胞以多肽和蛋白质依赖性的方式识别自体和恶性靶细胞
为了证明这些T细胞能够识别并攻击表达TGFβ的目标细胞，研究人员在体外扩增了TGFβ-33和TGFβ-38特异性T细胞。共培养实验表明，这些T细胞可以有效被负载相关多肽的自体树突状细胞激活，并上调包括颗粒酶B、颗粒溶素在内的细胞毒性分子。更重要的是，当与THP-1细胞（一种天然表达TGFβ的恶性髓系细胞系）共培养时，特异性T细胞的活化程度会随着THP-1细胞自身TGFβ表达的上调（经外源TGFβ1处理）而增强，并随着TGFβ被siRNA敲低而减弱，清晰地证明了这种识别是TGFβ依赖性的。
5. 转染TGFβ多表位mRNA的自体树突状细胞可激活具有不同特异性的T细胞
最后，研究探索了使用mRNA平台递送多表位疫苗的可行性。他们设计了一个包含TGFβ-02、-15、-33和-38序列的单一mRNA构建体（TGFβ-ALL）。将转录的mRNA电穿孔转染入自体树突状细胞后，这些树突状细胞能够有效地处理并呈递这些表位，成功激活了分别针对这四个不同TGFβ表位的特异性CD4+T细胞。这证实了单链mRNA编码多表位策略的实用性，为开发基于mRNA的多表位TGFβ疫苗提供了技术验证。
研究结论与重要意义
这项研究系统性地评估了多种TGFβ来源表位在PDAC患者中的免疫原性和临床相关性，为开发多表位TGFβ靶向免疫调节疫苗提供了坚实的科学依据。
首先，研究证实了TGFβ-33和TGFβ-38与已知的TGFβ-15一样，是强免疫原性表位，能够在健康人和患者中诱导功能性T细胞反应。更重要的是，发现了基线TGFβ-33特异性免疫与接受联合免疫治疗（ICI+放疗）的PDAC患者更好的生存结局显著相关。最关键的是，研究揭示了“多表位优势”：基线时能对多个TGFβ表位（TGFβ-15和TGFβ-33）产生免疫反应的患者，其生存获益最为显著。这从临床角度直接支持了临床前研究中观察到的多肽疫苗优于单肽疫苗的现象。
其次，机制研究证明，这些TGFβ特异性T细胞（主要是CD4+亚群）不仅具有促炎特性，还表现出细胞毒潜力，并能够以TGFβ依赖性的方式识别并攻击表达内源性TGFβ的靶细胞，包括恶性细胞系。这表明激活这些T细胞有望直接清除TME中高表达TGFβ的免疫抑制细胞和部分癌细胞。
最后，研究成功展示了利用单一mRNA构建体递送多个TGFβ表位，并有效激活相应特异性T细胞的可行性。这为将多表位疫苗策略转化为临床可用的mRNA疫苗平台铺平了道路。
综上所述，这项工作从免疫学基础、临床相关性、作用机制和技术平台四个层面，完整地论证了开发多表位TGFβ免疫调节疫苗用于治疗PDAC的合理性与前景。这种疫苗策略旨在“釜底抽薪”，通过动员机体免疫系统主动清除免疫抑制的“帮凶”，从而重塑肿瘤微环境，将其从“冷”转“热”，为增强现有免疫疗法（如ICIs、放疗）的疗效，乃至最终改善PDAC这一“癌王”的治疗困境，提供了一条充满希望的新途径。该策略不仅适用于PDAC，也有潜力扩展到其他具有高TGFβ活性和免疫抑制性TME的实体瘤及纤维化疾病中。
