《Nature Communications》：Continuous evolution of a halogenase enzyme with improved solubility and activity for sustainable bioproduction
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化学卤化法常缺乏立体选择性且使用有毒试剂，而现有卤化酶效率低、溶解性差，限制了应用。为解决此问题，研究人员通过开发基于氨酰-tRNA合成酶的卤化酶生物传感器，并利用噬菌体辅助连续进化（PACE）技术，成功进化出含有12个突变的高溶解性与高活性色氨酸卤化酶RebHEvo4。该突变体在体内分别将7-氯-和7-溴色氨酸产量提高了37倍和44倍，在生物反应器中产量达2.7 g/L，并能高效生产卤化色胺及基因编码的抗菌卤化肽，为卤化药物的可持续生物制造提供了强大工具。
在药物、生物材料和工业化合物的世界里，卤化（引入氯、溴等卤素原子）是一个点石成金般的魔法。它能够显著增强分子的稳定性，并赋予其新的、更有价值的生物活性，许多畅销药物都离不开这个关键修饰。然而，传统的化学卤化方法就像一把钝器，往往难以精准控制，导致产物缺乏立体选择性，同时还需要使用大量有毒有害的化学试剂，对环境极不友好。科学家们自然将目光投向了更温和、更精准的酶。自然界存在一类名为“卤化酶”的蛋白质，它们能够在水相中、温和条件下，高效且位点特异性地完成卤化反应，完美契合现代绿色化学的理念。但理想很丰满，现实却很骨感。天然存在的卤化酶，例如研究中常被作为模板的色氨酸卤化酶RebH，普遍存在“效率低下”和“溶解性差”两大顽疾，导致它们在生物反应器中的催化产率极低，根本无法满足工业化生产的需求。这就像发现了一座金矿，却缺乏高效的开采工具。如何突破天然卤化酶的效能瓶颈，开发出既高效又易于规模化应用的“超级卤化酶”，成为了合成生物学和生物制造领域亟待攻克的关键难题，也是推动卤化药物走向更环保、更经济生产路径的核心所在。
为了回答上述问题，研究人员在本研究中开展了一项系统的酶工程研究。他们瞄准了来自链霉菌的天然色氨酸卤化酶RebH，以其为起点，通过先进的定向进化技术，旨在创造出一个溶解性、催化活性及稳定性都得到革命性提升的突变体，以应用于卤化氨基酸、衍生药物分子乃至复杂肽类的高效生物合成。
本研究主要运用了以下几项关键技术方法：首先是噬菌体辅助连续进化（PACE），这是一种强大的体外定向进化平台，能够在数天至数周内实现蛋白质的快速、持续进化，无需人工干预筛选。其次，研究团队自主开发了一种基于氨酰-tRNA合成酶的卤化酶生物传感器，该传感器能够将卤化酶的活性转化为宿主细胞的生存优势，从而与PACE系统无缝耦合，实现高通量的功能筛选。此外，研究还涉及了酶学动力学分析、蛋白质结构与溶解度表征（如动态光散射、蛋白质纯化得率评估），以及利用生物反应器进行克级规模的发酵验证，以评估进化酶的实际应用潜力。
通过定向进化获得高活性卤化酶RebHEvo4
为了突破野生型RebH的局限性，研究人员设计并应用了一种创新的筛选策略。他们构建了一个基于大肠杆菌的遗传系统，其中卤化酶催化产生的卤化色氨酸，能够被一种工程化的氨酰-tRNA合成酶所识别并错误地掺入到细菌生存所必需的蛋白中，从而将卤化酶的活性与细菌的存活直接挂钩。研究人员将此生物传感器与噬菌体辅助连续进化（PACE）平台相结合，对RebH基因库进行了超过500小时的连续进化压力筛选。最终，他们获得了一个最优突变体，并将其命名为RebHEvo4。该突变体包含了12个关键氨基酸位点的替换，这些突变共同作用，极大地改变了酶的性能。
RebHEvo4的溶解性与体外活性显著提升
获得突变体后，研究人员首先评估了其基本生化性质。实验结果表明，与几乎不溶解的野生型酶相比，RebHEvo4在大肠杆菌中的可溶性表达量大幅提高，能够轻松获得大量可溶蛋白。进一步的体外酶活测定显示，RebHEvo4的活性也实现了飞跃。在优化条件下，其对色氨酸的催化效率（由kcat/KM值衡量）得到了显著增强，证实了进化不仅改善了溶解性，更直接提升了其核心催化能力。
RebHEvo4在体内高效合成卤化色氨酸及其衍生物
随后，研究转入更贴近实际应用的体内合成验证。在工程化的大肠杆菌宿主中表达RebHEvo4，用于生产7-卤代色氨酸。结果令人振奋：与表达野生型RebH的菌株相比，表达RebHEvo4的菌株在摇瓶培养中，7-氯色氨酸和7-溴色氨酸的产量分别提高了惊人的37倍和44倍。为了展示其规模化生产的潜力，研究人员在1升的生物反应器中进行补料分批发酵，最终实现了2.7 g/L的7-氯色氨酸产量，这证明了RebHEvo4在较高细胞密度和可控环境下依然保持卓越性能。此外，研究还将RebHEvo4与下游的色氨酸脱羧酶耦合，成功将卤化色氨酸转化为具有生物活性的卤化色胺（一类重要的神经递质衍生物），产量相较于野生型系统提升了36倍。
RebHEvo4用于基因编码抗菌肽的位点特异性卤化
最后，研究探索了RebHEvo4在复杂生物分子修饰中的应用。研究人员设计了一个双酶系统，将RebHEvo4与一个肽链载体蛋白（CPP）融合酶结合，实现了在核糖体合成的肽链上，对特定色氨酸残基进行位点特异性的卤化。他们成功制备了卤化修饰的乳链菌肽（Nisin）类似物。抗菌实验表明，这些经过卤化修饰的抗菌肽，其抑菌活性相较于未修饰的肽有了显著提升，这为开发新一代高效、可理性设计的抗菌药物提供了崭新的策略。
本研究成功通过噬菌体辅助连续进化（PACE）与新型生物传感器相结合的策略，将天然卤化酶RebH改造成为高性能突变体RebHEvo4。该酶拥有12个关键突变，其卓越的可溶性解决了长期以来制约卤化酶应用的瓶颈问题，而其催化活性的数量级提升（体内卤化色氨酸产量提高37-44倍）则实现了效能上的突破。RebHEvo4在生物反应器中达到克每升级别的产量，并能够高效合成卤化色胺及对复杂抗菌肽进行位点特异性卤化，充分展示了其强大的应用泛用性。这项工作的重要意义在于，它不仅仅是一个酶的优化，更提供了一套可推广的酶工程范式。它证明了通过合理的定向进化策略，可以彻底改变一类具有重要工业应用价值但先天不足的酶的性能。RebHEvo4的成功创制，为卤化药物、农用化学品和功能材料的绿色、可持续生物制造铺平了道路，有望减少相关行业对传统有毒化学卤化工艺的依赖，具有显著的环境和经济效益。该研究成果已发表在《自然-通讯》（Nature Communications）杂志上。
