26S蛋白酶体20S催化核心颗粒的逐步组装：酵母13S至15S前体复合物的结构解析揭示β亚基掺入的替代途径、Ump1/Pba1-Pba2的逐步折叠及其释放的调控机制

《Nature Communications》：Structural transitions in the stepwise assembly of proteasome core particles

为阐明26S蛋白酶体20S催化核心颗粒（CP）的组装机制，研究人员利用β7亚基C端截短（β7-ΔCTE）的酵母菌株富集了13S至15S前体复合物（PC），并通过冷冻电镜获得了其高分辨率结构。研究揭示了β亚基（β1、β5、β6）掺入的顺序存在替代途径，描述了伴侣蛋白Ump1的逐步折叠以及Pba1-Pba2与α环（α-ring）之间两个关键的瞬时相互作用。结果表明，α1亚基N端在协调Pba1?Pba2释放及CP成熟过程中发挥关键作用，为理解蛋白酶体生物发生提供了新的结构基础。

　　

在真核细胞的蛋白质质量控制和信号转导中，26S蛋白酶体扮演着核心执行者的角色。这台精密的“分子机器”负责降解被泛素标记的错误折叠或短寿蛋白，其功能异常与癌症、神经退行性疾病等多种人类疾病息息相关。26S蛋白酶体由两个19S调节颗粒和一个20S催化核心颗粒（CP）组成。20S CP本身是一个由28个亚基组成的、结构复杂的中空桶状复合体，其形成需要一系列专用的组装伴侣蛋白协助，过程高度有序。尽管对成熟的20S CP结构已了如指掌，但其“建厂”过程——即各个亚基是如何一步一步精准组装起来的——仍有许多谜团。特别是，那些被称为13S和15S的“半成品”前体复合物结构瞬变、丰度极低，如同组装线上的“快照”，难以捕捉，这限制了我们对其组装路径、质量控制机制以及伴侣蛋白如何协同工作的理解。为了解决这些问题，一个由多个研究机构组成的团队开展了一项研究，旨在解析酵母中这些早期组装中间体的高分辨率结构，以揭示蛋白酶体CP组装的分子细节。该研究最终以“Structural transitions in the stepwise assembly of proteasome core particles”为题，发表在国际知名期刊《Nature Communications》上。

为了完成这项研究，作者团队主要运用了以下几项关键技术：首先，他们巧妙地构建了能够富集天然组装中间体的酵母菌株。通过敲除β7亚基的C端延伸序列（β7-ΔCTE）来阻断15S前体复合物（PC）的二聚化，使其大量累积；同时，在缺失BLM10的背景下过表达伴侣蛋白Pba1-Pba2，并通过N端带有FLAG-6xHis标签的Ump1蛋白，利用串联亲和层析技术（镍柱和抗FLAG抗体珠）从酵母细胞中纯化出包含Ump1的各种前体复合物。其次，他们利用单颗粒冷冻电子显微镜技术，对纯化得到的蛋白样品进行成像和数据收集，最终解析了从13S-PC到15S-PC的六个不同组装中间体的高分辨率结构。此外，为了验证结构观察到的β亚基掺入顺序，研究人员还使用了基因敲低（将β5或β6的启动子替换为葡萄糖可抑制的半乳糖诱导型启动子）结合免疫印迹分析的方法，在体内证明了替代组装途径的存在。

研究结果

1. 从酿酒酵母中纯化体内形成的真实CP组装中间体

研究人员采用了一种创新的遗传学策略来获取未经突变的、天然的组装中间体。他们使用了β7-ΔCTE酵母菌株，该突变可阻碍15S-PC的二聚化，导致13S和15S-PC累积。为了避免因Pba1-Pba2被“困”在中间体上而造成其短缺，他们还在Δblm10背景下过表达了Pba1和Pba2，并通过带有FLAG-6xHis标签的Ump1进行亲和纯化。这种方法成功地从酵母细胞中富集了足够的材料，并通过冷冻电镜解析了六个早期PC的高分辨率结构，包括13S-PC、13S+β1-PC、13S+β1+β5-PC、13S+β5+β6-PC、15S-PC，以及一个在样品浓缩过程中形成的非生理性13S-13S+β5二聚体。这些结构覆盖了从13S到15S-PC的组装过程，其中15S-PC（包含β1-β6）的结构是首次被解析。

2. 15S-PC组装过程中β亚基的掺入不遵循单一固定顺序

对解析出的结构进行分析，并结合体内生化实验，研究揭示了一个重要发现：从13S-PC到15S-PC的组装并非只有一条固定路径。此前的研究基于在β1突变株中的观察，认为β5和β6的掺入先于β1。本研究虽然也观察到了包含β5和β6的13S+β5+β6-PC，但同时也首次解析了含有β1但缺乏β5/β6的13S+β1-PC，以及含有β1和β5的13S+β1+β5-PC。这表明β1可以在β5/β6之前掺入。通过构建可条件性敲低β5或β6表达的酵母菌株，并进行免疫沉淀-免疫印迹分析，研究人员在体内证实了这一点：在缺乏β5时，β1仍然可以掺入到13S-PC中。然而，在纯化的样品中，含有β5的复合物远比含有β1的复合物丰富，这表明尽管存在替代途径，但β5先于β1掺入可能是酵母细胞中更主要的组装路线。

3. S3/S4 β-发夹环的逐步重构为新生CP的激活做准备

在成熟的CP中，所有β亚基的S3/S4 β-发夹环位于与同一β环内右侧相邻亚基的接触面，并与对侧β环的亚基并置，对于稳定结构和催化位点的形成至关重要。通过比较不同组装中间体的结构，研究人员观察到这些环是逐步结构化的。例如，在13S+β5+β6-PC和15S-PC中，β4和β5的S3/S4环已经结构化，并与相邻亚基形成氢键网络，而这种结构化在更早期的13S+β1+β5-PC中并未出现，提示β6的掺入促进了这一结构转变。相反，催化亚基β1、β2和β5的S3/S4环在15S-PC中仍然是无序的。特别是对于β2，虽然其催化三联体残基（Thr¹, Asp¹⁷, Lys³³）在15S-PC中已接近到位，但关键的质子传递残基Asp¹⁶⁶及其所在的环区（第165-173位氨基酸）仍很灵活，且Ser¹²⁹距离Thr¹较远，这阻止了其自激活。这些发现表明，S3/S4环的结构化、活性位点残基的正确定位、前肽的切除以及CP的成熟是紧密耦联的，而最终的正确折叠很可能由15S-PC二聚化触发。

4. PC组装过程中Ump1的逐步（重新）结构化与β亚基的逐步加入和二聚化同步发生

Ump1是蛋白酶体组装的关键伴侣蛋白，在溶液中是无结构的。本研究发现，Ump1随着组装进程逐步折叠。在13S-PC中，其N端（第1-31位）和部分环区是无序的。β5的掺入促进了Ump1第34-47位残基（形成螺旋H3）的结构化，这部分与β5相互作用。而β6的掺入（或空间限制）似乎推动了第21-31位残基的折叠。当与包含所有亚基的晚期PC结构比较时，发现β7驱动15S-PC二聚化后，Ump1发生了显著的结构重排：β1和β6被β7“推”向最终位置，导致Ump1的N端完成折叠，同时其整体结构沿中心轴发生了约2?的压缩。这种重排破坏了Ump1与α3之间原有的相互作用（如Ump1-Asp¹³⁶与α3-Arg¹¹⁴），为Ump1最终被活性CP降解以及α环门的关闭创造了条件。

5. Pba1环在早期PC中介入α3和α4之间，其方式与活性26S蛋白酶体中的Rpt2相似

除了已知的Pba1和Pba2通过C端HbYX（疏水-酪氨酸-任意氨基酸）基序与α5/α6和α6/α7口袋结合，以及Pba1的N端穿过α环孔道外，本研究在所有早期PC结构中首次发现Pba1的一个特定环区（第93-109位残基）插入到α3和α4亚基之间的口袋中，并通过一系列氢键与之结合。这个相互作用非常重要，因为在缺乏α3亚基的突变株中，Pba1-Pba2无法结合到PC上。有趣的是，Pba1的这个环在α3/α4口袋中的占据方式，与26S蛋白酶体调节颗粒亚基Rpt2的C端HbYX基序在底物降解过程中插入同一口袋的方式非常相似。在15S-PC中，这个Pba1环的存在阻止了α4到达其在成熟α环中的最终位置。然而，在晚期PC结构中，这个环不再处于这个位置，表明它在15S-PC二聚化时被释放。

6. α1的N端参与级联信号传导以促使Pba1-Pba2从蛋白酶体PC上解离

在所有的早期PC中，α1亚基的N端（第3-16位残基）与Pba1、Pba2、α2和α3存在相互作用。比较15S-PC和晚期PC结构发现，15S-PC二聚化后，α1的N端发生了明显的重排，这改变了它与周围亚基的相互作用网络，并伴随着Pba1 N端在α环孔道中向α7方向的微小移动。为了探究α1 N端的功能，研究人员构建了缺失该片段的酵母突变株（α1-Δ2-16）。生化分析显示，此突变导致晚期PC大量积累，并且Pba1-Pba2伴侣蛋白无法从这些复合物上释放，尽管Ump1的降解似乎正常。进一步实验表明，如果同时缺失α3的N端，则可以“挽救”α1缺失导致的Pba1-Pba2释放缺陷。这说明α1的N端对于维持α亚基N端在组装CP中的正确排列至关重要，这种排列能确保在Pba1 N端仍位于α环孔道时，α3的N端保持“开放”构象，从而为Pba1-Pba2的释放创造条件。

结论与讨论

本研究通过解析酵母26S蛋白酶体20S CP组装过程中一系列关键前体复合物的高分辨率冷冻电镜结构，极大地增进了我们对这一复杂生物分子机器“组装流水线”的理解。主要结论和意义包括：

1. 1.
   揭示了灵活的组装路径：研究证实从13S-PC到15S-PC的组装并非线性单一途径，β1、β5和β6亚基的掺入存在替代顺序，其中β5先行的路径可能更为主要。这提示细胞的组装过程具有一定容错性和灵活性，可能受亚基可用性的调控。
2. 2.
   阐明了结构与功能的协同演进：研究清晰地展示了Ump1伴侣蛋白和β亚基催化位点（特别是S3/S4环）如何随着每个新亚基的加入而逐步结构化。这种“按需折叠”的模式确保了只有在正确的时间、正确的空间约束下，催化位点才能形成，从而防止了过早或不正确的激活，是组装质量控制的精妙体现。
3. 3.
   发现了Pba1-Pba2结合与释放的新机制：研究首次揭示了Pba1的一个环区（第81-117位）在早期PC中介入α3/α4口袋，模仿了26S蛋白酶体中Rpt2调节亚基的结合方式，这可能对初始结合和稳定早期中间体有重要作用。该环在二聚化时被释放。同时，研究首次明确了α1亚基N端在信号传递中的关键作用：其构象变化协调了α环N端的重新排布，这对于在正确时机“挤出”Pba1的N端、关闭α环门并释放Pba1-Pba2伴侣蛋白至关重要。α1 N端缺失导致的Pba1-Pba2释放缺陷，从功能上印证了这一结构观察。

综上所述，这项工作为我们提供了一幅前所未有的、关于蛋白酶体核心颗粒逐步组装的动态分子图谱。它不仅解答了关于组装顺序、伴侣蛋白作用机制的长久疑问，更重要的是，揭示了α环构象变化如何精确协调CP成熟与伴侣蛋白释放这一核心调控环节。这些发现对理解蛋白酶体生物发生相关疾病（如PRAID，一种与POMP/Ump1突变相关的自身炎症性疾病）的病理机制具有潜在意义，也为针对蛋白酶体组装过程的药物开发提供了新的潜在靶点和结构基础。