《Nature Communications》：Vascular invasion-associated gene expression is detectable in pre-surgical biopsies of stage I lung adenocarcinoma
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本研究聚焦I期肺腺癌（LUAD）中预测复发但术前难以评估的微血管浸润（VI）。研究人员通过整合RNA测序与空间转录组学，首次系统鉴定出可重复的VI相关基因特征，并开发了机器学习预测模型。该模型在独立队列中有效预测VI与复发，且在有限活检样本中展现出应用潜力，为I期LUAD术前风险分层提供了新的分子工具。
肺腺癌（Lung Adenocarcinoma, LUAD）是最常见的肺癌亚型。随着计算机断层扫描（CT）筛查项目的普及，越来越多的LUAD在早期（I期）就被发现。然而，即使是早期患者，其复发风险也存在显著差异。其中，微血管浸润（Microscopic Vascular Invasion, VI），即肿瘤细胞侵入动脉或静脉管腔，是肿瘤转移扩散的一条重要途径，并被证明是I期LUAD复发的一个强力且独立的预测因子。不仅如此，存在VI的I期LUAD患者可能从辅助化疗中获益。但问题在于，VI通常只在手术切除后的肿瘤标本中，通过病理学家的显微镜检查才能被发现。这种常规的病理学检查不仅耗时费力，而且对微小的VI病灶（直径小于1毫米）容易产生假阴性。更重要的是，术前活检的样本量非常有限，病理医生难以在其中准确识别出VI，这使得VI这一关键信息无法在手术前用于指导治疗决策，例如是选择肺叶切除术还是亚肺叶切除术。因此，临床亟需一种能够在术前就识别出这些具有高侵袭性、高复发风险的肿瘤亚群的生物标志物。
过去，基于RNA测序（RNA-seq）的研究大多致力于寻找与预后相关的基因签名，但这些签名往往缺乏可重复性。此外，病理报告通常将血管浸润（VI）和淋巴管浸润（Lymphatic Invasion, LI）合并报告为淋巴血管浸润（Lymphovascular Invasion, LVI），这模糊了两者在预后价值和生物学上的独立意义。近年来兴起的空间转录组学（Spatial Transcriptomics, stRNA-seq）技术，能够在肿瘤和肿瘤微环境的空间背景下解析与肿瘤侵袭相关的转录组变化，为阐明VI+ LUAD的生物学特性、改进检测方法提供了新的机遇。
为了回应这些挑战，一个由多机构组成的研究团队开展了一项深入研究，旨在揭示I期肺腺癌中与血管浸润相关的转录组学特征。他们希望通过结合多种前沿技术，不仅理解VI的分子基础，更致力于开发一种能够在术前活检中应用的预测工具。这项研究的结果最终发表在国际知名期刊《自然·通讯》（Nature Communications）上，为早期肺癌的精准诊疗带来了新的希望。
为了系统研究VI的分子特征，研究人员整合运用了多种关键技术。首先，他们组建了两个多中心的回顾性I期LUAD患者队列（来自Boston Medical Center和Lahey Hospital and Medical Center），对肿瘤样本进行了详细的临床病理学注释。核心的组学分析包括：对162个手术切除肿瘤样本进行bulk RNA-seq，以识别差异表达基因；以及对一个包含VI+和VI-肿瘤的子集（15个样本）进行高分辨率的空间转录组学（10x Genomics Visium平台）分析，以在空间背景下解析基因表达模式。在此基础上，他们利用生物信息学方法（如共识聚类、通路富集分析、线性混合模型）对数据进行分析，并基于bulk RNA-seq发现的VI签名，通过交叉验证的机器学习流程（广义线性模型配合岭回归）开发了一个VI预测模型。该模型随后在独立的验证队列、公开数据集（如TRACERx、TCGA）以及一个专门的术前活检样本队列中进行了验证。为了深入理解细胞来源，研究还利用已发表的单细胞RNA-seq图谱，通过CytoSPACE等工具对空间转录组数据进行细胞类型反卷积分析。最后，他们通过免疫组化（IHC）和RNAscope原位杂交等技术，在独立的LUAD样本中对关键的发现（如癌症相关成纤维细胞）进行了实验验证。
VI是I期LUAD复发最强的侵袭类型预测因子
研究人员首先在一个包含192例I期LUAD肿瘤的发现队列中确认，在四种肿瘤扩散模式（VI、LI、胸膜侵犯VPI、气腔播散STAS）中，VI是7年无复发生存期最强的独立预测因子。VI+肿瘤与远处复发的关联更强，这与肿瘤通过血管系统扩散的理论一致。
I期LUAD中VI相关的基因表达变化
通过对103个（质量控制后）手术切除肿瘤的bulk RNA-seq分析，研究团队比较了VI+和低度恶性潜能（LMP）肿瘤，鉴定出474个差异表达基因，并将其聚类为4个基因表达簇。这些簇具有不同的生物学功能：簇1（细胞周期相关）、簇2（上皮-间质转化EMT/血管生成相关）、簇3（缺氧/活性氧反应相关）在VI+肿瘤中表达上调；簇4（p53通路、细胞间黏附相关）在VI+肿瘤中表达下调。当在模型中纳入LI作为协变量后，与VI相关的基因信号依然很强，而与LI相关的信号则很弱，提示VI和LI是不同的分子过程。
VI基因簇与特定LUAD病理学特征在空间转录组学数据中相关联
为了探究VI签名基因在肿瘤内的空间分布，研究对15个肿瘤样本（7个VI+，8个VI-）进行了空间转录组学分析。他们发现，这4个VI基因簇在空间上是彼此分离的，并与特定的组织病理学特征相关联。例如，簇1和簇3的表达不仅在VI病灶内部显著增高，在高级别生长模式（如实体型、微乳头型、筛状型）区域也升高。簇2的表达则与促结缔组织增生性间质（Desmoplastic Stroma）区域高度共定位。重要的是，即使在仅分析高级别模式的区域时，VI+肿瘤中簇1、2、3的表达仍高于VI-肿瘤，簇4的表达则更低，表明VI签名捕捉的是一种独立于侵袭性生长模式本身的血管浸润表型。
VI签名反映了血管浸润相关的肿瘤特异性及肿瘤微环境变化
通过对空间转录组数据进行细胞类型反卷积，研究人员发现，表达簇2的区域富含癌症相关成纤维细胞（Cancer-Associated Fibroblasts, CAFs），特别是具有肌成纤维细胞特征的CAFs。进一步的分析显示，在bulk RNA-seq数据中，VI+肿瘤预测的肌成纤维细胞比例也显著高于VI-肿瘤。通过后续的免疫组化（检测COL1A1和POSTN）验证，他们确认VI+肿瘤的非促结缔组织增生性间质中，COL1A1+POSTN+的肌成纤维细胞比例更高。而在VI+肿瘤的促结缔组织增生性间质中，COL1A1+细胞的比例进一步大幅增加，但其中大部分细胞是POSTN阴性的。这些发现表明，VI相关的基因表达变化（尤其是簇2）涉及肿瘤微环境的深刻重塑，特别是CAFs的激活和扩增。
源自VI签名的预测模型在独立I期LUAD队列中得到验证
研究团队基于发现队列的差异表达基因，通过机器学习交叉验证流程，开发了一个包含48个基因的VI预测模型。该模型在发现队列中能够有效区分VI+和VI-肿瘤。在独立的验证队列中，该预测模型同样表现出优异的性能，并且与患者的7年无复发生存期显著相关。有趣的是，即使在VI-的肿瘤中，该预测模型的评分仍然与复发风险相关，并且在VI-肿瘤中，模型评分与坏死这一病理特征显著正相关。该模型在预测其他侵袭类型（如LI）时表现不佳，进一步支持了其针对VI的特异性。此外，在TRACERx、TCGA和Uppsala等公开数据集中，较高的VI预测评分也与较差的患者生存期相关。
VI预测模型可克服肿瘤内异质性并在I期LUAD患者的术前活检中预测VI
由于VI病灶非常微小，其生物标志物必须能够克服肿瘤内异质性（Intra-tumor Heterogeneity, ITH）。空间转录组学分析显示，即使是在距离VI病灶1毫米以外的“远端”区域，VI+肿瘤的预测模型评分也显著高于VI-肿瘤。利用TRACERx研究中多区域采样数据的分析进一步证实，该VI预测模型在不同肿瘤区域间的评分高度一致，表明其对肿瘤内异质性不敏感，即模型捕捉的是一种肿瘤整体的、促血管浸润的表型。最重要的是，在一个独立的、由24例I期LUAD患者的术前活检样本（福尔马林固定石蜡包埋，FFPE）组成的队列中，该预测模型仅凭有限的活检组织RNA-seq数据，就能以较高的准确度预测其匹配的手术切除标本中是否存在VI。预测模型的评分在匹配的活检样本和切除样本之间也表现出强相关性。模型在活检队列中展现出的高阴性预测值提示，它在临床上有望用于可靠地识别出VI低风险的肿瘤，从而可能支持亚肺叶切除术的决策。
结论与讨论
本研究系统地描绘了I期肺腺癌血管浸润的转录组学图谱。通过整合bulk RNA-seq、空间转录组学和机器学习，首次鉴定并验证了一个可重复的、与VI强相关的基因表达特征。该特征揭示了VI+肿瘤在细胞周期、EMT/血管生成、缺氧适应等通路上的激活，以及细胞黏附和免疫监视相关基因的下调。空间分析表明，这些变化不仅局限于被浸润的血管，而是弥漫分布于肿瘤及其微环境中，特别是与促结缔组织增生性间质和活化的癌症相关成纤维细胞（CAFs）密切相关。
基于此特征开发的VI预测模型，在独立队列中表现出强大的诊断和预后预测能力。尤为关键的是，该模型对肿瘤内异质性不敏感，并且成功地在临床常规获取的术前小活检样本中得到了验证。这为解决“VI难以术前评估”这一核心临床难题提供了概念验证。该预测模型捕捉到的生物学特征甚至能在病理学确认的VI-肿瘤中识别出具有高侵袭性表型（如伴有坏死）的亚群，提示其可能比传统病理学更敏感地揭示肿瘤的内在侵袭性。
这项研究的意义在于，它将一个关键的、但评估困难的病理学指标（VI）转化为一个可量化的、可术前获取的分子特征。这不仅有望提高病理学分级的一致性，改进I期LUAD患者的预后分层，更重要的是，为未来实现“精准肺外科”铺平了道路。通过在手术前识别出VI高风险的患者，医生可以更有依据地制定手术方案（如选择更彻底的肺叶切除术），或考虑纳入新辅助/辅助治疗。虽然仍需更大规模的前瞻性研究来最终确立其临床效用，但本研究无疑为早期肺癌的个体化管理开启了一扇新的大门。
