《Gels》：Dermal Fibroblasts Modulate Migration and Phenotype of Infiltrating Monocytes in Skin-Derived Extracellular Matrix Hydrogels
Xue Zhang,
Meng Zhang,
Linda A. Brouwer and
Martin C. Harmsen
编辑推荐：
为解决在模拟伤口微环境中研究免疫细胞募集和免疫-基质-间质细胞互作的挑战，研究人员开发了一种新型皮肤源性细胞外基质水凝胶模型，用于探究人单核细胞在人真皮成纤维细胞基质中的主动浸润与表型变化。研究发现，成纤维细胞的旁分泌信号增强了促血管生成因子的分泌，促进了内皮管形成；而直接的免疫细胞浸润则限制了单核细胞的穿透深度，减少了基质诱导的成纤维细胞激活，并与早期胶原丢失减缓相关，使系统向基质稳定表型转变。该模型为研究免疫-基质-基质-间质细胞在皮肤伤口愈合早期阶段（从炎症到增殖期过渡）的互作提供了一个实用且生理相关的三维平台。
论文解读
皮肤作为人体最大的器官，其伤口愈合过程是一场由多种细胞和信号分子精密编排的修复“交响曲”。在这个复杂的过程中，免疫细胞（特别是单核细胞/巨噬细胞）与皮肤内的“建筑师”——真皮成纤维细胞之间的“对话”，以及它们共同生活的“土壤”——细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）的动态变化，是决定修复走向是完美愈合、慢性不愈还是病理性瘢痕的关键。然而，模拟这场“对话”的时空背景——伤口相关的三维（3D）微环境，长期以来在实验室中是个挑战。传统的二维（2D）细胞培养在坚硬的塑料板上进行，细胞的形态和行为与其在柔软、立体的真实组织环境中大相径庭。为了更贴近真实地再现伤口早期修复阶段免疫细胞的“招募”以及它们与成纤维细胞、ECM之间复杂的相互作用，研究人员需要构建一个更具生理相关性的模型。为此，一篇发表在《Gels》上的研究，题为“Dermal Fibroblasts Modulate Migration and Phenotype of Infiltrating Monocytes in Skin-Derived Extracellular Matrix Hydrogels”，带来了新的突破。
为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下关键技术方法：
- 1.
皮肤源性ECM水凝胶的制备：从新鲜猪皮中通过化学和酶学处理（如胰蛋白酶、SDS、DNase等）进行脱细胞，保留天然ECM的生化成分和纳米纤维网络结构，制备成可溶胶-凝胶转变的水凝胶，作为仿生三维培养支架。
- 2.
三维共培养模型的建立：设计了两种模型。间接共培养模型使用Transwell小室，将人真皮成纤维细胞（NHDFs）封装的水凝胶置于上室，人单核细胞（THP-1）封装的水凝胶置于下室，允许可溶性因子交换但无细胞直接接触。直接共培养模型则将NHDFs封装在水凝胶底部，再将THP-1细胞悬液加在凝胶表面，通过温和离心使其物理附着并模拟向基质内的浸润过程。
- 3.
多模态检测与定量分析：包括免疫组织化学（IHC）染色（如CD45标记THP-1细胞，α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）标记活化的成纤维细胞）、苦味酸天狼星红（PSR）染色定量胶原纤维密度、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析相关基因（如VEGFA, ACTA2, MMPs/TIMPs, 炎症因子等）的mRNA表达水平，以及利用Matrigel上的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）管形成实验评估共培养上清液的促血管生成能力。所有图像均使用Fiji软件进行定量分析。
研究结果：
2.1.1. 与NHDFs直接共培养限制THP-1在皮肤源性水凝胶中的浸润
CD45免疫组化结果显示，在第5天，单培养的THP-1细胞可深入水凝胶（平均深度121.1 ± 15.9 μm），而在与NHDFs直接共培养时，THP-1细胞的迁移被显著限制，主要停留在凝胶表面附近（平均深度8.92 ± 2.27 μm），表明成纤维细胞的存在强烈抑制了单核细胞在3D ECM基质中的穿透。
2.1.2. THP-1细胞对NHDFs表型的影响
对成纤维细胞活化标志物α-SMA的分析表明，在间接共培养（仅可溶性信号）中，单核细胞的存在并未改变NHDFs的α-SMA表达水平。然而，在直接共培养（物理接触）中，THP-1细胞显著降低了成纤维细胞的早期活化水平（在初始接触时，α-SMA阳性细胞比例从79.1%降至54.3%），表明局部的、基于基质的细胞间相互作用减弱了水凝胶诱导的成纤维细胞向肌成纤维细胞的活化。
2.1.3. 间接共培养诱导胶原快速降解
通过PSR染色分析胶原密度发现，在间接共培养系统中，THP-1与NHDFs之间的旁分泌信号交换，加速了成纤维细胞介导的基质降解过程，导致胶原密度在5天内急剧下降，表明单靠可溶性因子就能驱动快速的ECM重塑。
2.1.4. 直接共培养减缓早期成纤维细胞介导的基质降解
在直接共培养系统中，研究人员通过比较水凝胶下层（富含成纤维细胞）与上层胶原的强度比值来评估降解。结果显示，在共培养第1天，该比值显著高于单培养组，表明THP-1细胞的物理存在或基于基质的信号，在早期阶段抑制了成纤维细胞驱动的胶原降解，起到了暂时的基质保护作用。但到第5天，这种差异消失，可能模拟了从早期血管生成阶段向基质重塑阶段的过渡。
2.1.5. NHDF/THP-1共培养物的分泌组促进体外血管生成
收集间接共培养24小时的条件培养基处理HUVEC，发现与单培养条件培养基相比，共培养条件培养基能显著增加HUVEC在Matrigel上形成的管状网络连接点和节段数量，表明由NHDFs和THP-1细胞相互作用产生的分泌组具有促血管生成特性。
2.1.6. 间接共培养中的旁分泌信号调节THP-1的基因表达谱
RT-qPCR分析显示，与THP-1单培养相比，与NHDFs间接共培养的THP-1细胞显示出独特的基因表达变化。例如，促炎细胞因子TNF-α和IL-1β的表达在共培养中迅速下降，而抗炎因子IL-10在第5天上调。更重要的是，促血管生成因子VEGFA在第1天被急剧上调（超过3倍），但在第5天回落至基线。同时，基质金属蛋白酶抑制剂TIMP1表达增加，膜型基质金属蛋白酶MMP14表达持续上调。这表明成纤维细胞通过旁分泌信号引导单核细胞/巨噬细胞表型向一个促血管生成、抗炎且调节基质稳定的方向转变。
2.1.7. 间接共培养中的旁分泌信号调节NHDFs的基因表达谱
对NHDFs的分析表明，THP-1细胞来源的旁分泌信号深刻影响了成纤维细胞的行为。与单培养相比，共培养的NHDFs中，经典的促纤维化标志物ACTA2（编码α-SMA）、COL1A1和COL3A1的表达在第5天被显著抑制，而促血管生成因子VEGFA和FGF2的表达则被上调。此外，转化生长因子-β1（TGF-β1）的表达在共培养中被显著削弱。这表明单核细胞来源的信号抑制了成纤维细胞的促纤维化程序，同时增强了其促血管生成潜能。
2.1.8. 直接共培养对NHDFs和THP-1s基因表达的影响
在直接共培养条件下，THP-1细胞表现出与间接共培养不同的表型，如巨噬细胞通用标记物（CD68, CD11b）和典型M2相关标记物（CD163, CD206）表达降低，而CD209和CD86随时间增加。同时，NHDFs的促纤维化基因（ACTA2, COL1A1, COL3A1）被强烈下调，而COL4A1和FN1（纤连蛋白）则相对保留。这支持了接触依赖性互作可选择性抑制促纤维化ECM沉积，同时维持某些基质成分的观点。
结论与讨论
本研究成功地建立了一个创新的三维皮肤源性ECM水凝胶模型，其核心新颖性在于模拟了伤口愈合中免疫细胞（单核细胞）主动浸润到成纤维细胞占据的基质这一关键过程。与传统的静态共培养或2D模型不同，该系统允许区分可溶性旁分泌信号与物理性细胞浸润对修复结局的影响。
研究的主要结论强调，免疫细胞浸润本身是一个关键的调节环节，而不仅仅是炎症的被动结果。首先，成纤维细胞能够限制单核细胞在三维基质中的迁移深度，这可能通过形成一种“基质地址代码”来塑造免疫细胞的空间分布。其次，免疫细胞与成纤维细胞的相互作用模式（间接 vs. 直接）导致不同的修复状态。仅靠可溶性信号会加速基质降解，而直接的物理浸润则与早期的基质保存、成纤维细胞活化减少以及向基质稳定表型（表现为TIMP表达增加，促纤维化标记物减少）的转变相关。第三，这种相互作用是双向的：成纤维细胞指导单核细胞/巨噬细胞向一个具有促血管生成潜力（早期VEGFA高表达）和调节性特征（CD209增加，促炎因子下降）的表型分化；反过来，单核细胞来源的信号抑制了成纤维细胞的促纤维化程序（下调ACTA2, COL1A1, TGF-β1），同时增强了其促血管生成功能（上调VEGFA, FGF2）。最后，共培养系统的分泌组能有效促进内皮细胞形成管状网络，验证了该模型在复制伤口愈合增殖期关键事件——血管生成方面的生理相关性。
这项研究的重要意义在于，它提供了一个高度生理相关的实验平台，用于剖析伤口愈合早期阶段（从炎症向增殖过渡）中，免疫细胞、成纤维细胞和ECM三者之间复杂的、时空动态的相互作用网络。它揭示了免疫细胞主动浸润在协调基质保存与血管支持之间的核心调节作用，为理解正常伤口修复与慢性伤口、过度疤痕形成等病理状况的差异提供了新的视角，并为开发针对这些疾病的免疫调节或基质靶向治疗策略奠定了基础。当然，研究也承认了其局限性，如使用THP-1细胞系而非原代细胞，以及对“直接接触”机制和ECM物理性质变化的探索尚不深入，这指明了未来研究的方向。
