《International Journal of Molecular Sciences》：Emerging CRISPR Approaches for Countering Immune Evasion: Insight from Recent Studies
Sadam Abubakar,
Latifat Abdulsalam,
Lamin Fatty,
Rimsha Kanwal,
Muhammad Naeem and
Irshad Ahmad
编辑推荐：
这篇综述聚焦于CRISPR/Cas9基因编辑技术在提升癌症免疫治疗疗效中的应用。文章系统阐述了肿瘤如何通过抗原不稳定性、免疫抑制微环境、检查点信号等多种机制逃避免疫攻击，并详细介绍了如何利用CRISPR功能筛选（包括肿瘤内在与免疫细胞内在筛选）鉴定关键免疫调节靶点（如PTPN2、TPST2、DHX37等）。在此基础上，综述深入探讨了CRISPR工程化改造免疫细胞（如编辑CAR-T细胞、TILs、NK细胞以增强其持久性与杀伤功能）以及靶向肿瘤内在逃逸基因的策略。最后，文章也展望了碱基编辑器等新兴技术带来的更高精度与安全性，并分析了当前面临的脱靶效应、递送挑战与伦理考量。全文为利用CRISPR克服免疫治疗耐药性提供了全面的视角和前沿方向。
1. 引言：免疫治疗的时代挑战与CRISPR的破局潜能
癌症免疫疗法，特别是免疫检查点阻断（ICB）和过继性细胞疗法（ACT），已成为肿瘤治疗的重要支柱。然而，肿瘤细胞会通过一系列复杂的“免疫逃逸”机制削弱治疗效果，包括降低抗原表达、营造免疫抑制性的肿瘤微环境（TME）以及上调PD-1/PD-L1等免疫检查点分子。这些机制导致了免疫治疗的原发性和获得性耐药。面对这一挑战，需要能够精准调控基因的工具来揭示并干预这些逃逸通路。CRISPR/Cas9系统，作为一种可编程、高效且灵活的基因编辑技术，正成为破解免疫逃逸、增强免疫治疗效果的利器。它不仅能用于大规模功能筛选以发现新的免疫调节靶点，还能直接工程化改造免疫细胞，赋予其更强的抗肿瘤能力。
2. 肿瘤免疫逃逸的核心机制
免疫逃逸是一个多层面、动态的过程，主要涉及三大方面：
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肿瘤内在变异性与抗原不稳定性：肿瘤内部存在高度异质性，不同克隆的抗原表达可能不同。在CAR-T疗法中，肿瘤细胞可能通过抗原丢失（如CD19阴性复发）或抗原掩蔽来逃避免疫识别。此外，CD19等抗原的异常剪接也会产生无法被CAR-T识别的异构体，导致治疗失败。
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免疫抑制性肿瘤微环境（TME）与细胞间相互作用：TME并非由肿瘤细胞独舞，其中充满了抑制免疫的“帮凶”，如调节性T细胞（Treg）、抑制性髓系细胞和基质成分。它们共同营造了一个抑制免疫细胞活化、浸润和功能的“冷肿瘤”环境，且各抑制通路间存在功能代偿，使得单一通路阻断往往效果有限。
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免疫检查点信号与抑制网络：PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIGIT等免疫检查点分子是T细胞功能的重要“刹车”。肿瘤细胞通过上调其配体（如PD-L1）或利用细胞内检查点（如NR2F6、PTP1B），持续抑制T细胞的抗肿瘤活性。耐药通常由肿瘤内在（如IFN-γ信号通路改变）和外在（TME介导）机制交织形成，而非单一因素所致。
3. CRISPR/Cas9：从机制到免疫应用的功能工具箱
CRISPR/Cas9系统源自细菌的适应性免疫系统，其核心是向导RNA（sgRNA）引导Cas9核酸酶在特定位点制造DNA双链断裂（DSB），随后细胞通过易错的非同源末端连接（NHEJ）或精确的同源定向修复（HDR）进行修复，从而实现基因敲除或精准编辑。
在免疫学研究中，CRISPR/Cas9的两大应用尤为突出：
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功能性筛选：通过全基因组范围的CRISPR敲除（LOF）或激活（CRISPRa）筛选，可以系统性地发现调控抗肿瘤免疫的关键基因。例如，在肿瘤细胞筛选中，发现了PTPN2、TPST2等新靶点，其缺失可增强干扰素-γ（IFN-γ）信号和抗原提呈，使肿瘤对免疫攻击更敏感。在免疫细胞（如CD8+T细胞）筛选中，则鉴定出如Dhx37、Dap5等负向调控T细胞适应性和抗肿瘤功能的内在因子。
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免疫细胞重编程：CRISPR不仅能“发现”靶点，更能直接“改造”免疫细胞。通过多重基因编辑，可以同时敲除CAR-T细胞中的内源性T细胞受体（TCR）、PD-1、TGFBR2等基因，从而避免移植物抗宿主病（GvHD）、增强细胞持久性并抵抗TME的抑制。此外，利用CRISPRoff/CRISPRon等表观遗传编辑工具或靶向SUV39H1等表观调控因子，可以在不切割DNA的情况下长效调控基因表达，将CAR-T细胞重编程为具有更强记忆和增殖能力的干细胞样状态。
4. 基于CRISPR的免疫逃逸克服策略
针对不同的逃逸机制和细胞类型，CRISPR技术已发展出多种精准干预策略。
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编辑免疫检查点：直接敲除T细胞上的PD-1、CTLA-4等抑制性受体，或敲除肿瘤细胞上PD-L1的转录调控因子（如ATXN3），能够有效解除免疫抑制，增强T细胞功能。研究也发现，靶向细胞内检查点如PTP1B（负调控JAK/STAT信号）或NR2F6（抑制炎性细胞因子转录），同样能显著提升T细胞和CAR-T细胞的疗效。
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工程化CAR-T细胞：CRISPR极大地优化了CAR-T疗法。通过敲除TRAC基因可实现通用型CAR-T制备；敲除CD7、CD52等基因可防止T细胞恶性肿瘤治疗中的“自相残杀”并抵抗清淋药物；敲除TGFBR2等基因可帮助CAR-T细胞抵抗TME中的抑制信号。这些编辑旨在解决CAR-T疗法在实体瘤中面临的浸润难、持久性差和抑制性微环境等瓶颈。
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工程化肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）：对于实体瘤，直接从肿瘤组织中分离、扩增并回输TILs是一种有前景的策略。利用CRISPR或更安全的碱基编辑器敲除TILs中的TIM-3、TIGIT、SOCS1等抑制性受体或信号蛋白，可以增强其扩增能力、细胞因子分泌和连续杀伤肿瘤的功能，已在黑色素瘤等模型中显示出更好的肿瘤控制效果。
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靶向肿瘤内在免疫逃逸基因：除了改造免疫细胞，直接破坏肿瘤细胞的逃逸“装备”也同样有效。利用CRISPR敲除肿瘤细胞中的CD47（“别吃我”信号）、GDF15、COX2/PGE2通路相关基因或Cop1等，可以重塑TME，将抑制性的M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAM）极化为抗肿瘤的M1型，从而增强免疫治疗的总体响应。
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新兴碱基编辑平台在NK细胞和CAR-T细胞工程中的应用：与传统CRISPR切割不同，碱基编辑器（如腺嘌呤碱基编辑器ABE、胞嘧啶碱基编辑器CBE）能在不引起DNA双链断裂的情况下实现单碱基的精准转换，安全性更高。在自然杀伤（NK）细胞中，碱基编辑器可用于选择性敲除特定的HLA等位基因，同时保留保护性等位基因（如HLA-E），从而制备出通用型且能逃避宿主NK细胞攻击的CAR-NK细胞。在CAR-T细胞中，碱基编辑器也已成功用于同时敲除TRBC、CD7、CD52等多个基因，制备通用型产品，并在早期临床试验中显示出疗效。
5. 挑战、考量与未来方向
尽管前景广阔，CRISPR技术在临床转化中仍面临多重挑战：
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安全性与脱靶效应：CRISPR/Cas9可能在某些非目标位点产生切割，导致意外的基因突变。多重编辑还可能增加染色体易位或大片段缺失的风险。采用高保真Cas9变体、优化sgRNA设计、使用核糖核蛋白（RNP）复合物瞬时递送以及转向碱基编辑或先导编辑等无需DSB的技术，是提高安全性的主要方向。
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递送挑战：如何将CRISPR组件高效、安全地递送到特定细胞（尤其是体内）是一大难题。病毒载体（如慢病毒）效率高但存在插入突变风险；非病毒方法如电转RNP、脂质纳米颗粒（LNP）和细胞外囊泡（EV）等则提供了更安全、可控的递送选择。
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伦理、生产与监管：体细胞编辑的临床应用需在严格的伦理框架和监管下进行，确保风险受益比合理。此外，符合药品生产质量管理规范（GMP）的大规模、稳定生产基因编辑细胞产品，以及对其基因组完整性进行全面表征，是产业化必须跨越的壁垒。
展望未来，CRISPR技术正朝着更精准、更安全、更强大的方向发展。碱基编辑、先导编辑、表观遗传编辑（CRISPRi/CRISPRa）等新技术将提供更精细的调控手段。结合人工智能的sgRNA设计将优化特异性和效率。将CRISPR筛选与多组学分析结合，能更深入地解析免疫应答的网络调控。最终，通过CRISPR技术实现的个性化、多功能工程化免疫细胞疗法，有望为攻克实体瘤和克服免疫治疗耐药带来革命性的突破。
