《International Journal of Molecular Sciences》：Functional siRNA Delivery via Jet Nebulization: Proof-of-Concept IL-1? Silencing in Macrophage-like THP-1 Cells
Duy Bao Tran Nguyen,
Ahmed S. M. Ali,
Dongwei Wu,
Johanna Berg,
Daniel C. Lauster,
Jens Kurreck and
Beatrice Tolksdorf
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本文针对吸入式RNA干扰（RNAi）疗法发展中高效递送siRNA至免疫和呼吸道细胞的关键技术难题展开研究。研究人员通过计算设计了三种靶向白细胞介素-1β（IL-1β）的小干扰RNA（siRNA），利用市售喷射雾化器结合Lipofectamine RNAiMAX递送体系，首次在体外模型中系统证明，siRNA-脂质体复合物经雾化后仍能保留其基因沉默活性，在THP-1来源的巨噬细胞样细胞中实现了显著的IL-1β蛋白敲低。该研究建立了一个实用、可及的体外平台，为未来开发治疗肺部或局部炎症性疾病的吸入式RNAi疗法提供了重要的方法学基础。
在慢性炎症的复杂交响曲中，白细胞介素-1β（IL-1β）扮演着至关重要的“首席乐手”角色。它主要由活化的巨噬细胞产生，是启动和放大免疫反应的核心促炎细胞因子。然而，当这位“乐手”失控，持续释放激昂的“炎症音符”时，便会驱动一系列病理过程，成为类风湿关节炎、炎症性肠病、慢性阻塞性肺疾病乃至癌症等疾病的幕后推手。传统的IL-1β抑制剂，如单克隆抗体，虽已用于临床，但常受限于高成本、全身性免疫抑制和潜在的免疫原性。此时，RNA干扰（RNAi）技术以其高特异性和高效率，提供了精准“静音”特定基因（如IL1B基因）的新策略。小干扰RNA（siRNA）作为RNAi的效应分子，能引导细胞内机器降解靶信使RNA（mRNA），从而阻止相应蛋白（如IL-1β）的合成。
对于呼吸道炎症疾病，将治疗药物直接递送到病灶部位是最理想的途径。雾化吸入作为一种非侵入性方法，可将药物直接送至肺部组织和免疫细胞，有望最大化局部疗效并减少全身副作用。然而，一个核心的科学问题悬而未决：在经历雾化过程的机械应力后，脆弱的siRNA能否保持其结构的完整性和关键的基因沉默功能？这正是阻碍吸入式RNAi疗法发展的关键方法学挑战。为此，Duy Bao Tran Nguyen, Ahmed S. M. Ali, Dongwei Wu, Johanna Berg, Daniel C. Lauster, Jens Kurreck 和 Beatrice Tolksdorf 在《International Journal of Molecular Sciences》上发表了一项概念验证研究，旨在建立一个简单、可及的体外平台，以验证经喷射雾化后的siRNA是否仍能有效工作。
研究人员运用了几个关键技术方法来搭建和验证这一平台。首先，他们通过生物信息学工具设计了三种靶向人IL1B基因的siRNA（siIL-1β.1, siIL-1β.2, siIL-1β.3），并进行了体外功能验证。其次，他们以THP-1单核细胞系为模型，通过佛波酯（PMA）诱导其分化为巨噬细胞样细胞（THP-1 Mφ），并用脂多糖（LPS）刺激模拟炎症状态，以此作为评估siRNA沉默IL-1β效果的功能性读数系统。第三，研究使用市售的PARI SINUS2喷射雾化器，结合3D打印的适配器和定制雾化舱，构建了siRNA雾化递送系统。最后，他们通过双荧光素酶报告基因检测、蛋白质免疫印迹（Western blot）和酶联免疫吸附测定（ELISA）等多种分子生物学技术，在不同层面（报告基因水平、内源蛋白水平）系统评估了siRNA的沉默效率和雾化后的功能保留情况。
研究结果
2.1. 靶向IL-1β的siRNA设计与沉默效率评估
研究人员通过计算筛选出三条靶向IL-1β的siRNA。细胞毒性实验表明，所有siRNA候选物在THP-1 Mφ中均表现出高细胞活性（>95%）。利用双荧光素酶报告系统在HeLa细胞中进行初步功能验证，结果显示在20 nM和40 nM浓度下，所有三条siRNA均能显著降低报告基因活性（降低至少97%），证明了其强大的沉默潜力。
2.2. 内源性IL-1β蛋白水平的敲低
在THP-1 Mφ模型中，通过常规正向转染20 nM siRNA并刺激LPS，评估了对内源性IL-1β蛋白的敲低效果。Western blot和ELISA结果一致表明，三条siRNA均能显著降低pro-IL-1β（31 kDa）和总IL-1β蛋白水平。其中siIL-1β.2效果最为显著，将蛋白水平降低了约85%（Western blot）和83%（ELISA）。
2.3. 雾化设置与细胞活性
研究建立了一个包含PARI SINUS2雾化器的定制雾化舱用于siRNA递送。细胞活性实验（XTT法和活-死染色）证实，即使去除培养基长达30分钟或进行雾化处理，THP-1 Mφ的细胞活性仍保持在95%以上，表明该雾化过程对细胞无毒。通过蓝色食用染料校准曲线测定，雾化沉积效率约为1.5%。凝胶电泳实验确定了用于后续雾化实验的siRNA-脂质体复合物的氮/磷（N/P）比为0.25。
2.4. 通过雾化进行siRNA递送
使用荧光标记的siRNA（siCon.Cy3）通过雾化递送至THP-1 Mφ，荧光显微镜观察显示红色荧光与细胞共定位，单细胞分析定量显示转染效率高达90.0 ± 2.5%，证明了雾化siRNA能被细胞高效摄取。
2.5. 雾化后siRNA的完整性与功能性
通过顺序转染实验（先转染报告质粒，6小时后通过雾化递送siRNA）在HeLa细胞中进行双荧光素酶检测。结果显示，雾化递送的siIL-1β.2仍能显著降低报告基因活性（降低96%），与阴性对照siCon相比有极显著差异。这直接证明雾化过程并未损害siRNA的基因沉默功能。
2.6. 雾化siRNA对内源性表达IL-1β的敲低
这是本研究最关键的验证步骤。THP-1 Mφ通过雾化接受siIL-1β.2处理，随后用LPS刺激。Western blot和ELISA分析均一致显示，与雾化siCon的对照组相比，雾化siIL-1β.2处理组的pro-IL-1β蛋白水平和总IL-1β蛋白浓度均显著降低，分别实现了约65%和62%的敲低。这确凿地证明，通过商用喷射雾化器递送的siRNA，能够在相关免疫细胞模型中有效沉默内源性炎症靶点基因。
研究结论与意义
本研究成功提供了一个方法学上的概念验证，表明siRNA-脂质体复合物在经历喷射雾化后，仍能在明确的体外系统中保留其基因沉默活性。核心结论是：使用市售、易得的喷射雾化器，可以实现功能性siRNA的雾化递送，并在人巨噬细胞样细胞中诱导可测量的IL-1β基因敲低。
这项研究的意义是多层面的。首先，它建立了一个实用、可及且可重复的体外平台，可用于在进入复杂的体内研究之前，系统性地表征和优化雾化siRNA的递送参数（如配方、雾化条件）。这符合当前减少对动物模型依赖的科研趋势。其次，它直接回应了吸入式RNAi领域的一个关键疑虑，即雾化的机械应力不会破坏siRNA的功能完整性，为后续疗法开发奠定了信心。最后，该研究聚焦于IL-1β这一重要的炎症靶点，并将THP-1巨噬细胞作为免疫应答模型，为治疗呼吸道或局部炎症性疾病的吸入式RNAi策略开发提供了初步依据。
当然，作者在讨论中也指出了本研究的局限性和未来方向。THP-1细胞系模型无法完全复现肺部复杂的微环境（如黏液屏障、多种细胞类型的相互作用）。因此，未来需要在原代巨噬细胞、混合气道细胞培养物以及更接近生理条件的三维（3D）肺模型或器官芯片系统中进行验证。此外，研究中使用的Lipofectamine RNAiMAX脂质体虽然在体外高效，但因其潜在的细胞毒性和炎症反应，不适用于体内治疗。未来研究需要探索生物相容性更佳的纳米载体，如脂质纳米颗粒（LNP）或可降解聚合物，以增强siRNA的稳定性、细胞内递送和内涵体逃逸。在技术层面，虽然喷射雾化器价格低廉且易得，但其存在“死腔”容积、雾化效率有限等缺点，未来可考虑使用沉积效率更高的振动筛网雾化器。
总而言之，这项研究迈出了关键的第一步，它将常见的医疗设备（雾化器）与前沿的基因沉默技术（RNAi）相结合，为开发下一代吸入式疗法打开了一扇新的大门。它不仅证实了一种方法的可行性，更重要的是提供了一个可供后续研究进行优化和拓展的标准化起点，有望加速针对肺部疾病的局部靶向治疗研发进程。
