《Pathogens》：Multi-Epitope DNA-Based Feline Immunodeficiency Virus Vaccine Construct Designed by Immunoinformatic and Machine Learning Tools as a Surrogate Model for HIV Vaccine Development
Tyler Michalka,
Abid Ullah Shah,
Tiffany Liang and
Maged Gomaa Hemida
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托斯卡纳病毒（TOSV）是夏季地中海地区脑膜炎的主要病原体，但近期其意大利流行株的基因组数据有限。为此，研究人员对2022-2025年间意大利中北部收集的34株TOSV分离株进行了全面的系统发育和基因型分析。结果表明，所有分离株均属于A谱系，且在托斯卡纳地区表现出显著的遗传隔离现象。S和M片段均受负选择压力。本研究证实了A谱系在意大利的主导地位，并证明了宏基因组新一代测序（mNGS）是有效的TOSV基因组监测工具，有助于制定更精准的公共卫生策略。
夏季的地中海地区，除了阳光沙滩，还有一种由沙蝇传播的病毒性威胁悄然潜伏——托斯卡纳病毒（Toscana virus, TOSV）。这种病毒是导致该地区夏季无菌性脑膜炎和脑炎的主要原因之一。自1971年在意大利托斯卡纳地区首次被发现以来，TOSV的分布范围已扩展至多个地中海国家甚至更远。然而，尽管其流行病学意义重大，关于当前在意大利流行的病毒株的详细基因组信息仍然相对匮乏，这限制了对病毒传播模式、进化规律和有效监测策略的理解。为了解决这些问题，Tyler Michalka、Abid Ullah Shah、Tiffany Liang和Maged Gomaa Hemida等研究人员开展了一项研究，对近期在意大利中北部流行的TOSV进行了全面的遗传学和进化分析，成果发表在期刊《Pathogens》上。
为了深入探究TOSV的流行特征，研究人员对2022至2025年间从意大利中北部（包括托斯卡纳、伦巴第、艾米利亚-罗马涅和威尼托大区）收集的34株TOSV分离株进行了深入研究。这些样本大部分来源于人类患者（32株，来自脑脊液、尿液、血浆和血清），另外2株则来自威尼托大区沙蝇的匀浆物。研究团队采用了宏基因组新一代测序（metagenomic Next-Generation Sequencing, mNGS）技术，结合靶向富集策略，对这些病毒的基因组进行了高通量测序。通过对病毒S（小）和M（中）基因组片段进行系统发育分析、遗传距离计算以及选择压力评估，研究人员系统描绘了当前TOSV在意大利的流行图谱和进化特征。
3. 结果
3.1. 测序与系统发育分析证实A谱系占绝对主导
研究团队成功对所有34株分离株进行了mNGS测序，平均基因组覆盖度达90%，平均测序深度为250X。通过构建S和M片段的系统发育树，并与已知的A谱系和B谱系参考序列进行比较，研究发现所有34株意大利分离株都聚类在A谱系内部或其附近，没有发现任何属于B谱系的病毒株。系统发育树内部节点显示出高支持率（自展值≥90%），且末端分支较短，表明这些病毒株具有较近的共同祖先，反映了持续的本地传播而非多次独立传入。从S和M片段计算出的平均进化距离也显示，这些分离株与A谱系参考株的遗传距离（分别为d=0.010和d=0.016）远小于与B谱系参考株的距离（分别为d=0.331和d=0.253）。
3.2. 基因组变异与选择压力分析
对基因组序列的深入分析发现，S片段（1869个核苷酸）和M片段（4209个核苷酸）分别存在73个和138个核苷酸突变位点，突变率分别为每位点3.84 × 10-2和3.27 × 10-2。在翻译后的蛋白质水平上，共鉴定出7个（S蛋白）和9个（M蛋白）非同义突变。更为重要的是，选择压力分析显示，S片段和M片段的非同义替换率与同义替换率之比（ω）均小于1（分别为ω=0.02和ω=0.48），这明确表明两个基因组片段都处于强烈的负选择（纯化选择）压力之下，意味着绝大多数改变氨基酸的突变对病毒可能是有害的，因此在进化过程中被清除，这有助于维持病毒关键蛋白功能的稳定性。
3.3. 托斯卡纳地区病毒株呈现显著的遗传隔离
研究人员按地理来源对分离株进行了分组，并计算了组内和组间的平均进化距离。一个关键的发现是，来自托斯卡纳大区（锡耶纳，n=10）的病毒株形成了一个独立且高支持率（自展值95%）的进化支。更重要的是，托斯卡纳组内的遗传多样性（S片段：d=0.030；M片段：d=0.039）显著低于该组与艾米利亚-罗马涅、伦巴第、威尼托等其他地区病毒株之间的遗传距离（p<0.05）。这种较低的组内遗传分化表明，托斯卡纳地区的TOSV种群传播相对独立，具有明显的地理区隔性，暗示存在一个局部、持续的传播循环，而与其他地区的大规模病毒交换有限。
综上所述，本研究通过对意大利中北部地区2022-2025年间流行的托斯卡纳病毒（TOSV）进行系统的基因组学分析，得出了几个关键结论。首先，A谱系是目前该地区绝对主导的流行谱系，未检测到B谱系的传播。其次，病毒的S和M片段基因组均受到强烈的负选择压力，限制了其蛋白质水平的大幅变化。最值得注意的发现是，来自托斯卡纳地区的病毒株形成了一个遗传上相对独立的群体，表现出显著的局部传播特征，这为理解病毒在区域内的传播动态提供了新视角。
这项研究的意义在于，它利用宏基因组新一代测序（mNGS）这一强大工具，更新了我们对意大利TOSV流行状况的认知，提供了高分辨率的病毒遗传学图谱。研究结果证实了mNGS在虫媒病毒监测和基因组流行病学研究中的有效性和实用性。对托斯卡纳地区病毒遗传隔离现象的揭示，提示公共卫生干预措施（如针对性的沙蝇防控）可以考虑在特定疫源地更加精准地实施。尽管研究存在样本地理覆盖范围有限、未能对L（大）片段进行完整分析等局限性，但其发现为后续更大规模的监测、病毒变异的功能性研究以及制定更有效的防控策略奠定了重要基础，强调了持续基因组监测对于应对TOSV这一重要公共卫生威胁的价值。
