利用高特异性小鼠抗人单克隆抗体（HbA1c-6C2）进行的增强免疫浊度法检测人HbA1c

《Analytical Biochemistry》：Latex-enhanced Immunoturbidimetric Assay of Human HbA1c Using a Highly Specific Mouse Anti-human Monoclonal Antibody (HbA1c-6C2)

糖尿病诊断指标糖基化血红蛋白（HbA1c）检测方法研究。采用高纯度抗人HbA1c单克隆抗体6C2，结合胶乳增强免疫浊度法（LEIBA）检测，验证其线性范围3.8%-14.0%，变异系数<1.5%，与HPLC法相关性系数达0.99，证实该方法灵敏度高、重复性好、与金标准一致。

　　

周玲|谢大峰|徐松|王江明|陈莎|黄俊福

松山综合医院，中国重庆星光街69号，401120

摘要

背景

糖尿病是一种日益常见的代谢紊乱疾病，通常通过临床评估进行诊断，包括空腹血糖和口服葡萄糖耐量测试。近年来，糖化血红蛋白（HbA1c）已成为糖尿病的关键诊断标志物。已经开发出多种检测HbA1c的方法，每种方法都有其优缺点。

方法

在这里，我们开发了一种高纯度和高特异性的抗人单克隆抗体（HbA1c-6C2），并将其用于乳胶增强免疫浊度测定法（LEIBA）来检测人血样本中的HbA1c。

结果

采用HbA1c-6C2的LEIBA表现出优异的分析性能。在3.8%至14.0%的HbA1c浓度范围内，线性关系得到验证，高浓度和低浓度水平下的重复检测变异系数均低于1.5%。与高效液相色谱法（HPLC）的方法比较显示强正相关（r = 0.99），表明该方法与既定的参考标准高度一致。

结论

抗人单克隆抗体HbA1c-6C2在LEIBA中的应用显示出良好的线性、高精度、稳定性和准确性，可用于检测人血中的HbA1c。

引言

糖尿病是一组由葡萄糖代谢异常引起的代谢紊乱疾病。这些疾病的特点是由于葡萄糖利用减少或产生过多而导致的高血糖，可能引发冠状动脉疾病、肾脏疾病、视网膜病变等并发症[1]。截至2021年，全球糖尿病患者数量估计为5.37亿，其中中国约有1.409亿[2]。几十年来，糖尿病的诊断主要基于血糖指标，包括空腹血浆葡萄糖（FPG）和75克口服葡萄糖耐量测试（OGTT）。血红蛋白A1c（HbA1c）是长期血糖控制的一个广泛使用的指标，反映了过去2到3个月的平均血糖水平。近年来，HbA1c测量的标准化使得国际专家委员会推荐将其作为糖尿病的诊断标准，其阈值为6.5%（国家糖化血红蛋白标准化计划（NGSP）单位[3]。

HbA1c是一种糖化血红蛋白（GHb），通过葡萄糖的醛基与HbA β链的氨基末端缬氨酸残基之间的缩合反应形成。这两个分子最初形成不稳定的醛亚胺（席夫碱），随后解离或发生阿马多里分子重排，形成稳定的酮胺化合物[4],[5]。已经报道了多种检测HbA1c的方法，包括高效液相色谱法（HPLC）[6]、酶测定法[7]、亲和色谱法[8]和电化学技术[9]等[5]。其中，HPLC被认为是HbA1c测量的金标准，因为它具有更高的精度和准确性；然而，它需要相对昂贵且大规模的设备[10]。在本研究中，我们开发了一种高特异性的小鼠抗人单克隆抗体（克隆HbA1c-6C2），并采用乳胶增强免疫浊度测定法（LEIBA）对其在人血样本中的含量进行了定量，并对该方法的性能进行了方法学评估。

样本收集

从松山综合医院就诊的GHb浓度不同的患者中收集了54份血液样本，这些样本保存在EDTA管中。样本在检测前被置于室温下，对比测试在2周内完成。该研究获得了松山综合医院伦理审查委员会的批准。

抗体的制备

血红蛋白β链的N端缬氨酸残基通过葡萄糖（C1位点）进行糖基化，随后与...

单克隆抗体的开发

筛选了四个亚克隆后，选择了杂交瘤6C2用于单克隆抗体的生产。腹水液和纯化的细胞培养上清液产生了小鼠抗人HbA1c-6C2，进一步鉴定其为IgG1亚型。此外，用这种抗体进行免疫后还产生了GAM IgG-2B4单克隆抗体。

纯度

HPLC分析显示小鼠抗人HbA1c-6C2和GAM IgG-2B4单克隆抗体均有一个主要峰，证实了它们的结构完整性（图1）。峰面积...

讨论

糖尿病是一组由葡萄糖代谢紊乱引起的慢性高血糖疾病，可能导致多种并发症。FPG和OGTT仍然是糖尿病临床诊断的标准方法。最近，标准化的检测方法将HbA1c纳入了诊断标准，阈值为6.5%（NGSP单位），同时它也是监测长期血糖控制的有效工具[11]。

目前，有多种...

CRediT作者贡献声明

陈莎：写作 – 审稿与编辑，监督，项目管理。黄俊福：写作 – 审稿与编辑，资金筹集。徐松：数据分析，数据管理。王江明：验证，数据管理。周玲：方法学研究，调查，数据分析。谢大峰：写作 – 初稿撰写，数据可视化

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数据可用性

数据可应要求提供。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们感谢来自Liwen Bianji (Edanz)（www.liwenbianji.cn）的Michelle Kahmeyer-Gabbe博士对本手稿英文文本的编辑工作。