将商业来源的酶以及Rhodotorula toruloides来源的 invertase 酶通过磁亲和作用固定在经过卵白蛋白A修饰的壳聚糖包覆的锰铁氧体纳米颗粒上

《Biocatalysis and Agricultural Biotechnology》：Magnetic affinity immobilization of commercial and Rhodotorula toruloides invertases on concanavalin A–functionalized chitosan-coated manganese ferrite nanoparticles

本研究开发基于Concanavalin A（ConA）功能化的锰铁氧体（MnFe?O?）-壳聚糖磁性纳米系统，通过亲和相互作用固定两种解糖酶，系统验证了其对糖基化酶的高效选择固定能力，并对比了商业解糖酶与Rhodotorula toruloides产解糖酶的催化性能、热稳定性及循环稳定性，发现该磁性纳米平台可显著提升酶的工业应用稳定性。

　　

Dania Alonso-Estrada|Nayra Ochoa-Vi?als|José Luis Martínez Hernández|Rodolfo Ramos-González|Georgina Michelena-álvarez|Rebeca Betancourt-Galindo|Anna Iliná

纳米生物科学小组，科阿韦拉自治大学化学科学学院，萨尔蒂略分校，V. Carranza大道和J. Cárdenas工程师路，萨尔蒂略，科阿韦拉州，25280，墨西哥

摘要

磁性亲和固定是一种提高工业生物催化中酶稳定性和可重复使用性的有效策略。在这项研究中，开发了一种基于Concanavalin A功能化的壳聚糖包覆锰铁氧体纳米颗粒（MnFe₂O₄–Ch–ConA）的凝集素介导的磁性纳米系统，用于糖基化转化酶的亲和固定。来自Saccharomyces cerevisiae的商业转化酶和由Rhodotorula toruloides产生的胞外转化酶通过凝集素-碳水化合物亲和相互作用被固定。该纳米系统通过一步共沉淀法合成，并通过FT-IR、HRTEM、EDX、DLS、ζ电位和磁测分析进行了表征。使用非功能化纳米颗粒进行的对照实验确认了非特异性吸附可以忽略不计，表明酶的结合主要是由亲和力驱动的。商业转化酶和R. toruloides转化酶的固定产率分别达到了94.6%和88.4%。固定后，两种酶的最佳pH值和温度得以保持，而热稳定性和长期储存稳定性也显著提高。非线性Michaelis–Menten分析显示表观Km值增加，这与异质生物催化系统的扩散限制一致，且催化性能没有显著损失。固定后的商业转化酶在30次重复使用循环后仍保持超过95%的活性，而R. toruloides转化酶在15次循环后仍保持超过70%的活性。这些发现表明，凝集素功能化的磁性纳米颗粒为选择性酶固定和可重复使用的生物催化提供了一个可靠的平台，为可持续的蔗糖水解和农业工业糖加工提供了有希望的应用。

引言

酶是高度选择性的生物催化剂，在许多工业过程中发挥着核心作用，包括食品加工、生物技术和生物精炼（Basso & Serban, 2019）。在这些酶中，转化酶（EC 3.2.1.26；β-果糖呋喃糖苷酶）催化蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖，生成比蔗糖更甜且不易结晶的转化糖（Kumar et al., 2021）。由于这些特性，转化酶被广泛应用于糖果制造、饮料生产、糖浆制造和发酵过程（Manoochehri et al., 2020）。

转化酶存在于植物、细菌和真菌中，其中酵母是最重要的微生物来源之一（Barbosa et al., 2018）。尽管Saccharomyces cerevisiae仍然是工业转化酶生产中最常用的生物体，但像Rhodotorula toruloides这样的非传统酵母由于其代谢多样性以及能够在低成本底物（如糖蜜、粗甘油、工业废水和木质纤维素水解物）上生长而越来越受到关注（Kot et al., 2020; Keskin et al., 2023）。除了脂质和类胡萝卜素外，R. toruloides还产生具有潜在工业意义的胞外转化酶（Barbosa et al., 2018; Alonso-Estrada et al., 2024）。然而，尽管转化酶具有高催化效率，但由于其操作稳定性低、对pH值和温度变化敏感、难以从反应介质中分离以及可重复使用性有限，自由状态的酶往往限制了工业应用（Datta et al., 2013）。

因此，酶固定作为一种有效策略应运而生，通过提高酶的稳定性来实现催化剂的回收，并允许其在不显著损失活性的情况下重复使用（Basso & Serban, 2019）。已经开发了多种固定方法，包括吸附、共价结合、包封和基于亲和力的方法，每种方法都会影响酶的取向、催化可及性和操作稳定性（Khan, 2021; Kumar et al., 2019; Polanía Melo et al., 2023）。其中，将酶吸附到功能化的固体载体上尤其具有吸引力，因为这种方法简单温和，且通常能保持酶的活性（Maghraby et al., 2023）。

近年来，纳米结构材料因其高表面积与体积比、可调的表面化学性质和改善的质量传递性能而被广泛研究作为酶固定的载体（Waifalkar et al., 2016）。磁性纳米颗粒尤其具有优势，因为它们结合了大的表面积和在外加磁场下的快速高效回收（Muley et al., 2020; Kumar et al., 2019）。它们的结构特性，包括形态、孔隙率和表面化学性质，显著影响酶的负载能力、催化可及性和操作稳定性（Bilal et al., 2018; Cavalcante et al., 2024）。像锰铁氧体（MnFe₂O₄）这样的尖晶石铁氧体是特别有吸引力的磁性材料，因为它们表现出强烈的磁响应性、化学稳定性和方便的合成路线，适用于生物技术应用（Akhlaghi and Najafpour-Darzi, 2021）。

表面功能化在决定酶固定效率和催化行为方面起着关键作用。不同的化学活化策略，包括氨基、醛基、环氧基和亲和力介导的方法，会影响酶在载体表面的取向和结合强度（Sheldon and van Pelt, 2013; Pagolu et al., 2021）。虽然共价结合可能会增强结构刚性，但也可能部分限制底物对活性位的可及性。相比之下，亲和力介导的固定提供了更温和的结合条件，并能在保持催化功能的同时实现选择性酶结合（Betancor and Luckarift, 2019; Zang et al., 2021）。

凝集素介导的亲和系统是固定糖基化酶的特别有吸引力的策略。像Concanavalin A（Con A）这样的凝集素能够特异性识别糖蛋白中常见的α-D-甘露糖和α-D-葡萄糖残基，从而通过碳水化合物介导的相互作用实现选择性酶结合（Bahar and Tuncel, 2004; Yavuz et al., 2004; Akkaya et al., 2009）。用壳聚糖等生物聚合物对磁性纳米颗粒进行表面修饰进一步提高了生物相容性，并引入了促进配体固定和酶结合的反应性官能团（Osuna et al., 2015; Ansari & Husain, 2022）。因此，凝集素功能化的磁性载体已被用于糖蛋白的识别和分离，特别是在蛋白质组学应用中（Tang et al., 2010; Dong et al., 2015; Selzer et al., 2022）。

将转化酶固定在磁性载体上已被报道可以提高其热稳定性、pH耐受性、储存稳定性和可重复使用性（Chen & Wu, 2014; Waifalkar et al., 2016; Cabrera et al., 2017; Polanía Melo et al., 2023）。然而，大多数先前的研究集中在Saccharomyces cerevisiae来源的转化酶上，而对于非传统酵母（如Rhodotorula toruloides）来源的转化酶的亲和固定研究较少。此外，关于在同一亲和功能化磁性平台上商业转化酶和非商业转化酶之间的比较分析也较为有限。尽管凝集素修饰的磁性纳米颗粒已被广泛用于糖蛋白富集，但尚未全面探讨将亲和力驱动的固定与使用非功能化对照进行选择性验证、非线性动力学建模和长期操作稳定性评估的整合。此外，与传统的Fe₃O₄核心相比，提供增强化学稳定性、可调磁性质和生物相容性的替代铁氧体组成（如MnFe₂O₄）在凝集素介导的生物催化系统中的应用仍然相对较少（Ochoa-Vi?als et al., 2026）。

据我们所知，这项工作是首次系统性地结合凝集素介导的亲和识别与MnFe₂O₄–壳聚糖磁性纳米系统，用于糖基化转化酶的亲和固定，并对来自商业和非传统酵母来源的酶进行了比较评估。

因此，本研究旨在开发和评估一种ConA功能化的MnFe₂O₄–壳聚糖磁性纳米系统，用于选择性亲和固定糖基化转化酶。特别强调了机制验证、使用非线性回归分析的动力学表征以及操作可重复性的评估，从而推动磁性凝集素介导的平台向更稳健的农业工业生物催化应用发展。商业转化酶和由Rhodotorula toruloides产生的胞外转化酶被固定在磁性纳米系统上，并在催化性能、动力学行为、热稳定性、储存稳定性和操作可重复性方面进行了比较，从而推动磁性凝集素介导的平台向更稳健的农业工业生物催化应用发展。

材料

所有试剂均为分析级。MnSO₄·H₂O、FeCl₃·6H₂O、NaOH、NaIO₄、蔗糖、培养基成分和缓冲盐均来自Jalmek（墨西哥）。低分子量壳聚糖（约75% DD）、Concanavalin A（Con A）、甲基-α-D-甘露吡喃糖苷和商业转化酶（Saccharomyces cerevisiae）购自Sigma–Aldrich。溶液使用去离子水配制。

微生物和发酵条件

Rhodotorula toruloides（MT372485.1）在YPED培养基中培养（30 °C，200 rpm，16–18小时）

Rhodotorula toruloides的胞外转化酶生产

Rhodotorula toruloides在含蔗糖的培养基中的浸没发酵产生了高效的生物量形成和胞外转化酶生产（表1）。生物量生长和胞外转化酶生产的时间曲线总结在表1中。R. toruloides转化酶的发酵动力学和生产行为的详细分析已在先前报道（Alonso-Estrada et al., 2024）。由于本研究重点关注固定性能

结论

基于MnFe₂O₄–壳聚糖–ConA的凝集素介导的磁性亲和纳米系统成功开发并验证为糖基化转化酶的选择性固定平台。磁性核心、生物聚合物涂层和生物凝集素配体被整合到系统中，以优化Rhodotorula toruloides产生的商业转化酶和胞外转化酶的吸附。高固定产率（商业转化酶和R. toruloides转化酶分别为94.6%和88.0%）

CRediT作者贡献声明

Anna Iliná：资源管理、项目行政、资金获取、数据管理、概念构思。Dania Alonso-Estrada：写作 – 审稿与编辑、原始草稿撰写、方法学研究。Nayra Ochoa-Vi?als：原始草稿撰写、方法学研究、调查、数据分析。José Luis Martínez Hernández：验证、监督、数据分析。Rodolfo Ramos-González：验证、监督、数据管理、概念构思。Georgina Michelena-álvarez：写作 – 审稿

未引用参考文献

Almeida et al., 2021; Singh et al., 2022; Zhang et al., 2021.

利益冲突声明

作者声明没有已知的竞争性财务利益。

数据可用性

支持本研究结果的数据可向相应作者索取。

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者感谢SECIGTI（墨西哥）通过博士奖学金计划和研究项目CF-2023-G-472提供的财务支持。作者感谢CIQA和ICIDCA与科阿韦拉自治大学化学科学学院的合作及技术支持。