《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Plasma exosomal miR-181a-5p is linked to osteoporosis by mediating endothelial-osteoblast crosstalk and regulating bone remodeling
编辑推荐：
血浆外泌体miR-181a-5p在骨质疏松患者中显著高表达，通过靶向OPG和ZFP36L1抑制成骨细胞增殖分化及骨形成。内皮细胞来源的外泌体miR-181a-5p可能介导内皮-成骨通讯，为诊断和治疗提供新靶点。
梁素楠|夏明辉|吴龙飞|何佩|卢欣|邓飞燕|雷书峰
中国江苏省苏州市苏州医科大学公共卫生学院遗传流行病学与基因组学中心，邮编215123
摘要
目的
阐明血浆外泌体miR-181a-5p与骨质疏松症（OP）之间的关联。
方法
招募了三个独立的病例对照队列，通过定制的miRNA阵列和RT-qPCR技术分离血浆外泌体，以识别与OP相关的miRNAs。使用ROC曲线评估关键miRNA的诊断性能。通过慢病毒（LV）感染构建过表达miR-181a-5p的内皮细胞（EC）系。将EC外泌体（EC-Exos）与MC3T3-E1成骨细胞共培养，或直接与MC3T3-E1细胞共培养，以检测miR-181a-5p对成骨细胞功能（增殖、分化和活性）的体外影响。预测miR-181a-5p的靶基因，并通过双荧光素酶报告基因检测进行验证。
结果
在三个独立队列中，OP患者的血浆外泌体miR-181a-5p水平均显著升高。miR-181a-5p的转染上调通过靶向3’UTR抑制OPG和ZFP36L1基因的活性，并显著抑制MC3T3-E1细胞中的成骨细胞基因表达（ALP、COL1A1、RUNX2和OCN）、分化（ALP活性）和骨形成（钙化）。EC可能是循环中外泌体miR-181a-5p的一个重要来源。与LV-miR-181a-5p-ECs-Exos共培养或直接共培养的MC3T3-E1细胞中，成骨细胞基因表达和分化显著受到抑制。
结论
这些发现不仅揭示了一种新的EC-成骨细胞通信途径，还表明血浆外泌体miR-181a-5p是一个有前景的OP诊断生物标志物和潜在治疗靶点。
引言
骨质疏松症（OP）是一种全身性代谢性骨病，其特征是骨量低、骨微结构退化以及骨折风险增加[1]。2020年全球OP患者人数达到2亿[2]，尤其在老年人中发病率较高[3]。随着人口老龄化，OP已成为一个重要的公共卫生问题[4]。
外泌体（Exos）是一种直径为30-120纳米的细胞外囊泡（EVs），由多种细胞类型分泌[5]。外泌体被脂质双层包裹，富含蛋白质、代谢物、mRNAs和miRNAs，在体液中长期运输过程中仍保持高生物活性[6]。
最新研究表明，骨重塑事件受外泌体中携带的关键因素调控[7]。作为外泌体中富集的小型非编码RNA，miRNAs在运输到效应细胞后可以结合靶基因的3’UTR区域发挥调控作用[8]。多项研究显示，外泌体miRNAs在骨重塑中起关键调控作用。例如，骨髓间充质干细胞/干细胞来源的外泌体（BMSC-EVs）可通过内吞作用将miR-196a传递给成骨细胞，从而调节成骨基因表达并促进成骨细胞分化[9]。脂肪组织来源的干细胞（ASC-EVs）通过转移miR-21-5p促进骨髓来源的间充质干细胞（BM-MSCs）迁移并抑制RAW264.7细胞的破骨细胞分化[10]。然而，我们对与骨相关的血浆外泌体miRNAs的了解仍然有限，还有许多具有潜在转化意义的功能性外泌体miRNAs有待发现。
作为细胞间通信的关键介质，外泌体被认为在血管内皮细胞和骨细胞之间的相互作用中起核心作用。骨是一种高度血管化的组织，其稳态依赖于血管，其中特定类型的血管（如人类H型血管）在老年人和OP患者中可作为敏感的骨量生物标志物[11, 12]。在这个血管系统中，内皮细胞（ECs）不仅构成血管内层，还与骨保持重要的通信网络，积极支持骨形成[13]。例如，SHN3敲除小鼠表现出增加的EC水平，通过SLIT3/ROBO1途径促进骨形成[14]。最近的研究进一步扩展了EC的调控能力，包括代谢信号和翻译后修饰（PTMs），强调了EC-骨通信的多方面性质[15, 16]。尽管对EC-骨相互作用的认识不断加深，但外泌体作为介质的潜在作用——特别是EC来源的外泌体miRNAs如何调控骨重塑——仍需进一步探索，这也是本研究的重点。
为填补上述研究空白，本研究通过三个独立的病例对照队列系统地识别了与OP相关的外泌体miRNAs差异。重点关注关键候选miR-181a-5p，明确了其细胞来源（内皮细胞）和靶细胞（成骨细胞），并进一步阐述了其在骨形成中的外泌体介导的调控机制。我们发现多种与OP显著相关的外泌体miRNAs，其中外泌体miR-181a-5p可能由内皮细胞分泌并传递给成骨细胞，抑制成骨细胞基因表达、分化和骨形成，这可能与骨密度降低和OP风险增加有关。
材料与方法
本研究的工作流程见图S1，并详细说明如下。
血浆外泌体的分离与鉴定
三个病例对照队列的基本特征总结在表S2中。透射电子显微镜和颗粒大小分析显示，分离出的血浆外泌体呈圆形（图S2A），直径约100纳米（图S2B），并且CD63和CD81呈阳性（图S2C）。
OP患者中外泌体miR-181a-5p显著上调
在通过定制miRNA阵列分析的768种外泌体miRNAs中，有39种miRNAs在病例组和对照组之间存在丰度差异
讨论
本研究筛选了与OP相关的外泌体miRNAs，并验证了miR-181a-5p在OP中的重要性。ROC曲线表明，血浆外泌体中的miR-181a-5p能有效区分OP患者和健康对照组。在OP患者中观察到的miR-181a-5p上调通过直接靶向OPG和ZFP36L1基因抑制成骨细胞分化。新兴证据表明，人类内皮细胞可能是其中的重要贡献者
作者贡献声明
夏明辉：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，正式分析。吴龙飞：方法学，研究，数据管理。何佩：方法学，研究，数据管理。卢欣：方法学，正式分析，数据管理。邓飞燕：撰写 – 原稿，监督，项目管理，资金获取。雷书峰：监督，项目管理，方法学，资金获取。梁素楠：可视化，验证，正式分析
知情同意
所有参与者在参与项目前均已签署知情同意书。
利益冲突
夏明辉、梁素楠、吴龙飞、何佩、卢欣、邓飞燕和雷书峰声明没有利益冲突。伦理批准
本研究设计已获得苏州大学机构研究伦理委员会批准（SUDA20200622H01，批准日期：2020年6月22日），符合赫尔辛基宣言的伦理标准。数据可用性声明
本研究的数据可应合理要求向相应作者获取。资助
本研究得到了国家自然科学基金（82373587、82173529、82173598和82103922）以及江苏省高等教育机构重点学术发展计划项目的支持。作者衷心感谢国家重点研发计划（2023YFC2509900）的支持。利益冲突声明
夏明辉、梁素楠、吴龙飞、何佩、卢欣、邓飞燕和雷书峰声明没有利益冲突。
