印度德哈拉敦SRHU医院收治的新生儿败血症病例中，对多重耐药且高毒力的肺炎克雷伯菌进行了基因组测序

《Microbiology Resource Announcements》：Draft-genome sequencing of multidrug-resistant hypervirulent Klebsiella pneumoniae from neonatal septicaemia at SRHU, Dehradun, India

本研究从印度SRHU新生儿败血症患者血液中分离出4株高毒力耐多药克雷伯菌，基因组测序揭示其携带多重耐药基因及不同质粒类型，为临床治疗及感染控制提供依据。

　　

摘要

多重耐药性使得革兰氏阴性细菌Klebsiella pneumoniae成为日益严重的威胁，并成为新生儿败血症的主要致病菌。在印度德赫拉敦的SRHU医院，我们从新生儿血流感染中发现了四种高毒力的多重耐药菌株，这突显了它们的临床意义以及对治疗和感染控制的影响。

公告

Klebsiella pneumoniae是一种非运动性的杆状革兰氏阴性细菌，是医院内感染的主要原因，尤其是在免疫功能低下的患者中（1）。在这项研究中，我们对从印度患有败血症的新生儿血液样本中分离出的多重耐药、高毒力Klebsiella菌株进行了de novo基因组测序。我们在德赫拉敦SRHU医院的新生儿重症监护病房收集了疑似败血症患者的血液样本，并将其放入儿科BacT/Alert血液培养瓶中，然后送往微生物学部门进行分析。所有纳入研究的菌株均来自研究期间（2023–2024年）微生物学实验室收到的临床样本。培养瓶在37°C下孵育。当检测到微生物生长时，我们立即进行了革兰氏染色显微镜检查，结果显示为典型的革兰氏阴性、短小、圆胖的荚膜杆菌。随后在5%羊血琼脂和MacConkey琼脂（MA）上制备了亚培养物，并在37°C下需氧培养18–24小时。在MA琼脂上观察到乳糖发酵的黏液样菌落，强烈提示存在Klebsiella菌种。进一步通过16s rRNA测序进行分类学确认。抗生素敏感性测试使用Himalayan Institute of Medical Sciences, SRHU医院的Vitek 2自动化系统进行，并按照CLSI标准指南进行解释（2）。对于分子分析，我们使用Xploregen DNA分离试剂盒从单个菌落中提取DNA，并使用QUBIT 3荧光计精确测定DNA含量。接着，我们使用Kappa DNA文库制备试剂盒对样本进行测序准备。这包括将100 ng的完整DNA酶切成233–300 bp的片段，然后进行末端修复，使末端平直，再在3'端添加一个“A”核苷酸并进行环状接头连接。经过USER酶切割接头后，使用AMPure珠子纯化材料。最终PCR扩增（六轮）使用NEBNext Ultra II Q5 Master Mix、Illumina通用引物和样本特异性八聚体引物进行。测序使用Illumina NovaSeq 6000平台进行，测序长度为151 bp。生成的序列数据经过FastQC v0.12.1进行严格的质量评估（3），并使用Trim Galore去除接头。原始读段使用Unicycler v0.5.0组装（4），随后通过Medusa 2.0进一步处理以确保高质量结果。我们使用BUSCO 5.8.2确定基因组完整性（6）。基因组注释使用NCBI-PGAP（7）。最后，使用ResFinder 4.7.2（8）和PlasmidFinder 2.1（9）在二次组装数据中识别抗菌素耐药基因和质粒。K型鉴定使用Pathogenwatch（https://pathogen.watch/）完成。所有工具均使用默认参数。表1列出了测序基因组的总体统计信息。

表1

表1 四个测序基因组的基因组统计概览

基因组名称	读段数量	基因组完整性	基因组覆盖度	N50	GC%	预测的耐药抗生素	质粒类型
HIMS_HL_K004	6.4M	98.9	169.12×	5,372,713	54	阿兹特雷南、头孢哌酮、头孢克肟、头孢托肟、头孢唑啉、头孢他啶、头孢曲松、头孢噻吩	IncFIB(pKPHS1) IncFIB(pNDM-Mar) IncFII IncHI1B(pNDM-MAR) IncR
HIMS_HL_K013	6.2 M	98.7	174.23×	5,322,099	57	头孢哌酮、头孢克肟、头孢托肟、头孢唑啉、头孢他啶、头孢噻吩、阿莫西林、阿莫西林+克拉维酸、氨苄西林、氨苄西林+克拉维酸、美罗培南、哌拉西林、哌拉西林+他唑巴坦	ColKP3 IncFIA IncFIB(pB171) IncFII
HIMS_HL_K019	7.6M	98.9	212.56×	5,288,603	57	阿莫西林、阿莫西林+克拉维酸、氨苄西林、氨苄西林+克拉维酸、阿兹特雷南、头孢哌酮、头孢克肟、头孢托肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢噻吩、亚胺培南、美罗培南、哌拉西林、哌拉西林+他唑巴坦	ColKP3 IncFII
HIMS_HL_K020	5.4M	98.5	152.41×	5,275,872	58	阿莫西林、阿莫西林+克拉维酸、氨苄西林、氨苄西林+克拉维酸、阿兹特雷南、头孢哌酮、头孢克肟、头孢托肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢噻吩、厄他培南、美罗培南、哌拉西林、哌拉西林+他唑巴坦	ColKP3 IncFII

HIMS_HL_K004和HIMS_HL_K013都具有K-64抗原类型，携带bla-TEM、bla-NDM和bla-CTX-M基因。HIMS_HL_K019和HIMS_HL_K020属于K2类型，携带bla-TEM1B、bla-NDM5和bla-SHV106基因。K2类型在全球范围内普遍存在且具有高度毒性，而K64类型在某些地区较为普遍，并且由于其与碳青霉烯类抗生素耐药性的关联而成为新的威胁。