基于AuNPs@Fc@MgAl-LDH与MB-cDNA@AuNPs双重信号放大的微RNA-21的敏感比率电化学检测方法

《Bioelectrochemistry》：Sensitive ratiometric electrochemical detection of microRNA-21 based on dual signal amplification of AuNPs@Fc@MgAl-LDH coupled with MB-cDNA@AuNPs

非编码RNA作为肿瘤生物标志物，其检测技术创新至关重要。本研究通过整合ferrocene修饰的MgAl-LDH与AuNPs@Fc@MgAl-LDH复合结构，构建了双信号放大比色电化学DNA生物传感器，以ratiometric信号（IMB/IFc）实现抗干扰检测，检测限达0.757 fM，血清验证回收率95.3%-101.4%，为临床早期膀胱癌诊断提供新工具。

姜兰|邹琳娜|董静|张萍|周健|江浩|任焕宇|牛慧茹|廖浩|张晓静|安珊珊|任飞|葛秀红|杨飞燕|程朗|潘洪志|荣胜中|马洪坤

中国牡丹江医学院公共卫生学院，牡丹江

摘要

非编码RNA是重要的肿瘤生物标志物，因此其在检测技术方面的创新具有重要意义。为了克服传统单信号电化学生物传感器的局限性（易受干扰、稳定性不足），本研究开发了一种具有双信号放大的新型比率电化学DNA生物传感器。其核心创新在于合理整合了两种协同作用的纳米材料：铁氰化物功能化的镁铝层状双氢氧化物（Fc@MgAl-LDH，作为稳定的固定基质和内部参考信号源）以及与MB-cDNA@AuNPs耦合的AuNPs@Fc@MgAl-LDH，构建了级联信号放大路径。该传感机制包括两阶段放大：第一阶段由高负载能力的AuNPs@Fc@MgAl-LDH实现，第二阶段由MB-cDNA@AuNPs与电极固定的microRNA-21（miRNA-21）杂交完成。比率信号（I Mb/I Fc）能够实现内置校正，从而提高检测准确性和重复性。经过系统优化后，该传感器具有宽线性范围（1.0 fM–0.1 nM）和极低的检测限（0.757 fM），无需RNA提取或酶促放大，简化了操作流程。血清验证显示其检测准确率高达95.3%–101.4%，表明其具有很强的临床诊断潜力。

引言

癌症是全球第二大死亡原因，其特征是体内细胞异常且不受控制地增殖，可侵袭周围组织，破坏正常生理功能，最终导致危及生命的状况[1]，[2]。膀胱癌已成为一个重大的全球健康挑战，给医疗系统和患者预后带来了巨大负担[3]，[4]。早期检测对于改善治疗效果、降低死亡率及提高长期生存率至关重要[5]，[6]。作为肿瘤发生的关键分子指标，miRNA-21通过抑制肿瘤抑制基因（如PTEN）发挥致癌作用，其上调与恶性转化密切相关[7]。临床研究证实，膀胱癌患者血清中的miRNA-21水平显著升高[8]，这突显了其诊断和治疗潜力。然而，在疾病早期阶段，其浓度处于微量水平，因此开发高灵敏度和选择性的检测方法对于膀胱癌的早期诊断至关重要。现有的主流检测技术（如qPCR [9]、RCA [10]、荧光 [11] 和ECL [12]）存在复杂核酸提取、设备昂贵及操作依赖性强等局限性，限制了其在即时检测中的应用。因此，亟需开发一种兼具高灵敏度、高选择性、操作简便和低成本的新miRNA-21检测平台。

电化学生物传感器基于电化学转导原理识别目标生物分子，具有操作简便、易于集成、高灵敏度和强特异性等优势[13]，[14]。随着核酸放大技术的进步，DNA成分已被系统地整合到传感平台中，使特定核酸杂交事件转化为可量化的电信号，从而实现对目标的定性和定量检测。Khodadoust等人开发了一种双信号标记的发夹结构DNA（dhDNA）传感系统，在电极界面共固定了内部参考探针（MB-HCP）和检测探针（Fc-AP-21）。该系统通过目标miRNA-141/21介导的链置换反应引发电化学信号变化，实现两个目标的同时检测。利用DNA杂交的特异性，它在复杂血浆样本中仍保持高准确性，为早期多标志物检测提供了理想平台[15]。Zouar等人对rGO/AuNPs复合修饰电极进行了系列研究：一方面采用“三明治”杂交配置结合目标miRNA-21标记探针和捕获探针，并利用纳米载体信号放大和无酶检测的优势，实现低至5 fM的超高灵敏度和选择性检测，同时能够区分单碱基错配；另一方面提出了一种无需预处理的策略，即在碳电极上固定DNA捕获探针，并利用目标RNA杂交的信号变化机制抑制铁氰化物电子转移。无需RNA提取或扩增等步骤，细胞提取物/血清样本可在30分钟内直接检测，实现fM级别的精确定量[16]，[17]。

生物传感器的性能核心在于其界面材料，这些材料通过优化电子转移效率、改善生物催化剂的负载和稳定性以及调节反应微环境，直接决定了检测灵敏度、选择性和使用寿命[18]。层状双氢氧化物（LDHs）作为一种二维纳米材料，因其高比表面积、可调结构和易于功能化而成为理想选择[19]，[20]。其中，通过层状镁铝双氢氧化物与AuNP负载形成的复合结构，结合了LDH的结构优势和AuNP的优异导电性和生物相容性，进一步提升了传感性能。吴等人利用层状介孔碳、AuNPs和含铁氰化物的甲酸通过层层自组装技术（Fc@MgAl-LDH）制备了用于检测癌抗原125的无标记电化学免疫传感器[21]。为克服检测准确性的瓶颈，广泛采用了双信号比率电化学传感策略，利用Fc和亚甲蓝（MB）等电化学活性物质构建信号系统。Luo等人开发了一种无需放大的比率电化学DNA生物传感器，基于锁相核酸辅助的链置换反应“Y”形结构实现简单转换，使用Fc和MB作为信号开启和关闭指标，获得了良好的检测结果[22]。与传统单信号电化学生物传感器相比，比率电化学DNA生物传感器利用两个信号的比率作为最终输出信号，有效避免了背景干扰，具有良好的内置校正能力，提高了检测和分析的准确性、重复性和抗干扰能力[23]，[24]。

在本研究中，制备了一种基于Fc@MgAl-LDH纳米材料的比率电化学DNA生物传感器。电极用(AuNPs/Fc@MgAl-LDH/AuNPs)复合材料修饰，SH-cDNA通过Au-S键固定在(AuNPs/Fc@MgAl-LDH/AuNPs)上。在miRNA-21存在下，它可以与SH-cDNA结合生成Fc的峰电流作为内部参考信号，然后引入MB-cDNA@AuNPs作为信号放大元件。当一个miR-21分子被SH-cDNA捕获时，可以结合多个MB-cDNA分子到电极表面，从而放大MB信号，形成“比率”效应，实现miRNA-21的超灵敏度和高选择性检测。本研究的主要优势包括：使用Fc@MgAl-LDH和AuNPs纳米材料作为基底，具有多金属中心、多孔结构、高生物相容性和无毒性的优点，同时充分利用AuNPs的良好导电性和生物相容性；此外，能够促进互补序列的接枝，从而提高检测灵敏度。使用MB-cDNA@AuNPs作为信号放大元件，一个被SH-cDNA捕获的miRNA-21分子可以结合多个MB-cDNA分子到电极表面，产生强烈的MB信号。其中，Fc和MB两种电活性剂分别作为参考和信号放大剂，共同提升了传感器的检测性能。

试剂

Bioengineering有限公司（中国上海）提供了miRNA-21和SH-cDNA（序列见表S1）。氢氧化钠（NaOH）、Tris-EDTA缓冲液、三水合铁氰化钾（K4Fe(CN)6·3H2O）、三氰化铁钾（K3[Fe(CN)6）和氯化钠（NaCl）由上海McLean生化有限公司（中国上海）生产。Mg(NO3)2·6H2O和Al(NO3)3·9H2O购自辽宁全瑞试剂有限公司（辽宁辽宁）。Tris(2-羧乙基)膦（TCEP）来源于

Fc@MgAl-LDH和AuNPs复合材料的表征

Fc@MgAl-LDH的SEM图像（图1A）显示了与已发表文章[21]中描述类似的分层结构。此外，Fc@MgAl-LDH的平均粒径约为100 nm。AuNPs的SEM图像（图1B）显示其典型的球形特征，这与本研究中的HTEM结果一致（图1C）。

采用傅里叶红外光谱（FTIR）分析了

结论

本研究基于Fc@MgAl-LDH纳米材料开发了一种用于miRNA-21检测的比率电化学DNA生物传感器。Fc@MgAl-LDH化合物作为基底构建了生物传感器界面，SH-cDNA接枝在AuNPs上用于识别miRNA-21，MB-cDNA@AuNPs用于结合并捕获电极表面的miRNA-21，从而放大电信号。该方法已用于检测不同浓度的miRNA-21

CRediT作者贡献声明

姜兰：撰写——原始草稿。邹琳娜：撰写——原始草稿。董静：可视化。张萍：资源准备。周健：方法学设计。江浩：数据管理。任焕宇：方法学分析。牛慧茹：形式化分析。廖浩：资源支持。张晓静：软件开发。安珊珊：验证工作。任飞：实验研究。葛秀红：项目指导。杨飞燕：概念构思。程朗：实验研究。潘洪志：形式化分析。荣胜中：撰写——审稿与编辑。马洪坤：撰写

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了黑龙江省春燕计划青年科技人才团队项目（CYQN24028）、国家自然科学基金（82173568、82473682、81703269、81973097、82273687、82473682）、黑龙江省自然科学基金（LH2023H054）以及牡丹江医学院博士后科研基金（2022-MYHJ-014）的财政支持。