《Cancer Letters》：Genome-wide CRISPR/Cas9 screen identified MCL1 as a senolytic target for clearing palbociclib-induced senescent and PD-L1-positive cells in colorectal cancer
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靶向治疗耐药机制与联合疗法优化研究：CDK4/6抑制剂palbociclib诱导结直肠癌细胞衰老并伴随SASP分泌，导致耐药和免疫抑制。通过CRISPR/Cas9筛选发现MCL1是关键靶点，联合palbociclib与MCL1抑制剂可诱导衰老细胞凋亡，增强CD8+ T细胞活性，抑制肿瘤生长并提高裸鼠存活率。
王海阳|沈天琪|杨遂遂|周晓辉|曹平平|余宏|何凯新|傅敏|于汉阳|刘晓荣|周婷婷|王静|黄明德|钱旭|王秀星|王强虎|刘丽|范志宁|张英健|林帆
南京医科大学第一附属医院消化内科，中国南京210029
摘要
结直肠癌（CRC）是全球最常见的消化系统恶性肿瘤。目前迫切需要开发针对CRC的有效靶向治疗方法。临床前研究表明，CDK4/6抑制剂帕博西利布（palbociclib）能够抑制CRC的生长，但其效果是否持久尚不清楚。本研究旨在评估帕博西利布诱导的衰老作用，并寻找新的策略以最大化其在CRC治疗中的效果。动物和细胞实验发现，帕博西利布诱导的衰老及相关的分泌表型（SASP）会导致耐药性、抗凋亡、PD-L1上调以及CD8+ T细胞功能受到抑制。通过CRISPR/Cas9筛选，我们确定了MCL1作为在帕博西利布存在下清除衰老CRC细胞的靶点。机制上，帕博西利布诱导的衰老细胞会上调ZHX2及其转录靶点MCL1，使其对凋亡和T细胞介导的细胞毒性产生抗性；而将帕博西利布与MCL1抑制剂联合使用则通过激活外源性和内源性凋亡途径显著诱导衰老细胞的凋亡。最后，我们提出了一种包括帕博西利布预处理加上帕博西利布与MCL1抑制剂联合治疗的“seno-therapy”方案，发现该方案能有效抑制肿瘤生长并提高CRC移植小鼠的生存率。除了其衰老清除作用外，seno-therapy还能减少PD-L1阳性细胞并增强CD8+ T细胞的细胞毒性。总之，共同靶向CDK4/6和MCL1可有效清除帕博西利布诱导的衰老CRC细胞，为CRC治疗提供了一种基于CDK4/6抑制剂的可行策略，从而实现长期肿瘤抑制并降低进展或复发的风险。
引言
结直肠癌（CRC）是全球第三大常见癌症，也是最常见的消化系统恶性肿瘤，与高死亡率相关[1]。目前的治疗主要依赖于传统化疗，针对CRC的靶向疗法仍然较少[2]。周期依赖性激酶4和6（CDK4/6）是关键的细胞周期调控因子，也是新兴的治疗靶点。帕博西利布作为首个获得FDA批准的CDK4/6抑制剂，在ER+ HER2-转移性乳腺癌中显示出高效性[3][4]。越来越多的证据表明其在其他癌症中也具有抗肿瘤作用，包括CRC，在临床前模型中已证实其疗效[5][6]，目前正处于I-II期临床试验阶段，用于转移性或晚期CRC的单独治疗或联合治疗（NCT03446157、NCT05039177、NCT03981614）。
最新研究表明，帕博西利布的作用机制比最初认为的更为复杂[7]。除了抑制细胞周期外，帕博西利布还诱导多种生物学效应，如细胞衰老和凋亡[8][9][10]、代谢改变[11]、溶酶体调节[12][13]以及肿瘤微环境重塑[14]。特别值得关注的是其与PD-L1调控和免疫检查点治疗的关联[13][14][15]，尽管其背后的机制仍不明确[16]。重要的是，这些非靶点效应可能因具体情况和癌症类型的不同而具有益处或危害，这对扩大帕博西利布的临床应用提出了挑战。
CDK4/6抑制剂治疗的另一个已知生物学效应是诱导肿瘤细胞衰老[9]。衰老是一种稳定的细胞周期停滞状态，曾被认为是一种有益的治疗结果。然而，最新研究表明，衰老细胞会分泌多种因子（SASP），如细胞因子、生长因子和蛋白酶，从而改变肿瘤微环境。虽然SASP在癌症中可能具有双重作用，但它也可能通过促进上皮-间质转化和血管生成等过程导致慢性炎症、免疫抑制和肿瘤进展[17][18]。尽管衰老相关的细胞周期停滞看似有益，但衰老细胞在肿瘤微环境中的持续存在往往是有害的。因此，将促进衰老的疗法与衰老清除策略结合使用以消除这些细胞对于实现持久的抗肿瘤反应至关重要[19][20]。遗憾的是，目前尚不确定单用帕博西利布是否能达到足够的长期抗肿瘤效果，或者是否可以通过衰老清除策略来减少衰老相关的“副作用”并最大化其疗效。
本研究旨在评估帕博西利布诱导的衰老对CRC的影响，并确定能够清除帕博西利布诱导的衰老CRC细胞的靶点。通过全基因组CRISPR/Cas9高通量筛选，我们发现髓系细胞白血病1（MCL1）可能是帕博西利布的作用靶点。我们的研究结果表明，采用帕博西利布预处理（诱导衰老）加上帕博西利布与MCL1抑制剂联合治疗的双管齐下方法，不仅能够有效诱导凋亡，还能增强CD8+ T细胞的细胞毒性，最终延长CRC移植小鼠的生存期。
部分内容摘录
细胞系
人类结直肠癌细胞系HT29、HCT116和DLD1均购自中国国家认证细胞库。HT29和HCT116细胞在完全DMEM培养基（90% DMEM、10%胎牛血清、100 U/mL青霉素-链霉素）中培养，而DLD1细胞则在完全RPMI 1640培养基（90% RPMI 1640、10%胎牛血清、100 U/mL青霉素-链霉素）中培养。所有细胞培养均在含有5% CO2的湿润环境中、37°C下进行。
帕博西利布诱导的衰老和SASP对CRC治疗具有不利影响
首先，我们建立了AOM/DSS诱导的结肠癌小鼠模型，以评估帕博西利布治疗的体内效果（图1A）。与对照组相比，帕博西利布治疗显著减少了肿瘤数量（图1B-C），降低了Ki-67阳性增殖细胞的数量，并以剂量依赖性方式增加了CRC中的衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色（图1D）。此外，该治疗还上调了衰老标志物p53和p21的表达。
讨论
我们的研究强调了治疗诱导的衰老在癌症治疗中的复杂作用，并强调了针对不同癌症类型采用特异性衰老清除方法的必要性。尽管像帕博西利布这样的CDK4/6抑制剂已在临床应用超过十年，但其非CDK4/6相关的生物学效应仍不完全清楚，尤其是在非乳腺癌中。我们发现，在结直肠癌中，帕博西利布诱导的衰老和SASP通过ZHX2–MCL1通路抑制凋亡，从而促进治疗抵抗。
作者贡献声明
周晓辉：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、监督、资源提供、数据分析。周婷婷：数据可视化、方法学设计。刘晓荣：数据可视化、方法学设计、实验研究、数据分析。黄明德：数据可视化、资源提供。沈天琪：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、监督、资源提供、数据分析。王静：结果验证、方法学设计。王海阳：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、结果验证、软件使用。
伦理批准
本研究获得了南京医科大学伦理委员会的批准（伦理编号：2011031）。所有动物实验均按照南京医科大学实验室动物护理委员会批准的程序进行，符合美国国立卫生研究院关于实验室动物护理和使用的指南。
数据可用性声明
本研究使用和/或分析的数据集可向通讯作者索取。利益冲突声明
作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。致谢
本研究得到了国家自然科学基金（82573945、32170738）、国家自然科学青年基金（82500632、82303894、82200564）、江苏省基础研究计划（BK20251124、BK20220311）、中国博士后科学基金（2022M721408）、南京医科大学第一附属医院青年学者培养基金（PY2023033）、江苏省癌症医院的科研项目（YSZD202405）以及江苏省的其他资助。
