对一大群中国不育男性进行CCDC146基因测序后发现，患有弱精症的患者存在新的突变

《CHINESE MEDICAL JOURNAL》：Sequencing the CCDC146 gene in a large cohort of infertile Chinese men reveals novel mutations in patients with asthenoteratozoospermia

该研究在中国男性不育群体中发现CCDC146基因杂合突变，并通过小鼠模型和蛋白质组学证实其通过调控MIP蛋白复合体影响精子鞭毛形成，为男性不育的分子机制和诊断提供依据。

　　

致编辑：不孕症是一个普遍存在的健康问题，全球有数百万人受到影响，其中大约一半的病例由男性因素导致，许多病例的病因仍然不明，据认为具有潜在的遗传基础。^[1]尽管已知许多与男性不育相关的基因在小鼠中存在，但这些信息转化为人类应用的进展较为缓慢。^[2]在没有基因诊断的情况下，临床医生很难评估辅助生殖技术的潜在成功率以及后代的生殖健康状况。

含有卷曲结构域（CCDC）的蛋白质被认为在精子发生过程中起功能性作用。^[3]与小鼠精子发生过程中关于CCDC蛋白的丰富研究相比，人类生育领域中与CCDC相关的发现仍然知之甚少。最近的研究表明，CCDC146基因的缺失会导致小鼠出现精子鞭毛生物发生缺陷，从而引发不育。^[4]然而，仅在两名患有弱精症（asthenoteratozoospermia）的法国男性中发现了CCDC146突变。^[5]因此，CCDC146突变与人类不育之间的因果关系需要进一步确认，尤其是在中国人群中。 在这项研究中，我们对657名患有弱精症的中国不育男性进行了全外显子测序。我们的研究遵循了赫尔辛基宣言的原则，并获得了四川大学华西第二医院伦理审查委员会的批准（批准编号：2019040）。所有参与者均签署了知情同意书。有趣的是，在来自不同家庭的四名患者中初步发现了CCDC146的双等位基因变异：一名患者携带c.778dup的纯合移码突变，另一名患者携带c.640C >T和c.1339dup的复合杂合突变，还有一名患者携带c.1339dup的纯合移码突变，最后一名患者携带c.296del的纯合移码突变[图1A；补充表1，https://links.lww.com/CM9/C806]。此外，Sanger测序证实未受影响的父母是这些变异的杂合携带者，而在931名正常对照组中未发现这些变异；患者精子裂解物的Western blot分析进一步显示CCDC146蛋白发生了降解[补充图1A和1B，https://links.lww.com/CM9/C806。

图1：

CCDC146的缺失会导致人类和小鼠的不育。(A) 四名弱精症患者的家系图。患者用黑色箭头标出。(B) 不育患者精子的扫描电子显微镜（SEM）分析（刻度尺，5 μm）。(C) 不育患者精子鞭毛的超微结构透射电子显微镜（TEM）分析（刻度尺，250 nm）。(D) 通过TEM分析显示，患者精子中散布的线粒体、MTDs和精子头部大量存在。(E) Ccdc146敲除（KO）小鼠精子的SEM分析（刻度尺，5 μm）。(F) Ccdc146 KO小鼠精子超微结构的TEM分析（刻度尺，500 nm）。(G) 文氏图显示了Ccdc146 KO小鼠下调的睾丸蛋白与CCDC146相互作用蛋白之间的19个重叠MIPs。(H) WT和Ccdc146 KO睾丸中Tektin家族蛋白的Western blot分析。(I) 免疫荧光染色显示小鼠精子中CCDC146和Tektins的共定位（刻度尺，5 μm）。(J) 共免疫沉淀（Co-IP）实验显示CCDC146与小鼠睾丸中的Tektins相互作用。(K) 在HEK293T细胞中进行的兩步Co-IP实验。BP：基底板；Co-IP：共免疫沉淀；M：线粒体；MTD：外围微管双体；PC：近端中心粒；SC：分段柱；SEM：扫描电子显微镜；TEM：透射电子显微镜；WT：野生型。

接下来，我们分析了这些患者中与CCDC146突变相关的精子表型特征。这四名患者的精子表现出明显的运动能力下降，并且精子尾部存在异常，包括短小、卷曲、弯曲或不规则的形状[图1B；补充表2，https://links.lww.com/CM9/C806]。此外，透射电子显微镜（TEM）结果显示精子鞭毛具有不规则的“9 + 2”结构，包括紊乱或缺失的外围微管双体（MTDs）和外层致密纤维（ODFs），以及缺失的中心对（CPs），这些现象在CCDC146突变患者的精子中尤为明显[图1C图1D为了验证CCDC146在精子发生中的关键作用，我们创建了Ccdc146敲除（KO）小鼠，发现Ccdc146 KO小鼠完全不育[补充图2A–H，https://links.lww.com/CM9/C806]。正如预期的那样，KO小鼠的精子形态与患者的畸形精子相似[图1E]。然而，KO小鼠的精子超微结构缺陷更为严重，鞭毛严重受损且分散，仅能检测到少数具有不规则“9+2”结构和线粒体的精子[图1Fhttps://links.lww.com/CM9/C806], 这表明CCDC146可能仅在鞭毛发育过程中起关键作用。

为了探讨CCDC146调节鞭毛形成的分子机制，我们对WT小鼠和Ccdc146 KO小鼠的睾丸进行了蛋白质组学分析。GO分析显示下调的蛋白质与精子发生相关[补充图4A，https://links.lww.com/CM9/C806]。有趣的是，下调最显著的蛋白质是装饰MTD内表面的MIP蛋白，这些蛋白对MTD的稳定性至关重要[补充图4B，https://links.lww.com/CM9/C806。^6]为了进一步研究CCDC146的相互作用蛋白，我们使用小鼠睾丸进行了免疫沉淀-质谱（IP-MS）分析。重要的是，微管内蛋白（MIPs）明显富集了CCDC146。特别是检测到了23种MIPs，其中19种在KO小鼠中下调[图1G 在这些下调的MIPs中，TEPP和SMRP1分别将Tektin4纤维与RIBC2和TEKTIP1连接起来，从而增强了微管结构的稳定性6^]。随后，我们通过Western blot验证了KO小鼠中Tektin4的下调（由于缺乏TEPP、TEKTIP1和SMRP1的抗体）[图1H图1I, 1JTektin4、Flag-Tepp和Myc-Ribc2过表达质粒，并将它们转染到HEK293T细胞中，通过共免疫沉淀（Co-IP）实验验证了TEPP、Tektin4和RIBC2复合物[图1K图1K图1H图1I, 1J 值得注意的是，接受ICSI治疗的Ccdc146 KO小鼠表现较差。注射后，WT组的大部分胚胎中都能观察到原核，而Ccdc146 KO小鼠产生的胚胎受精率显著降低（8.9%），同时两细胞期（6.0%）和囊胚期（0.6%）的形成率也显著下降[补充图5，https://links.lww.com/CM9/C806]。这些数据表明CCDC146在小鼠的受精和早期胚胎发育中具有特定的生物学作用。 总之，我们的研究在中国人群中筛查了CCDC146突变，并在多名无关的弱精症男性中发现了新的CCDC146突变，强调了针对特定人群的遗传学研究在发现新的疾病相关变异方面的重要性。此外，我们揭示了患者和小鼠中CCDC146缺失相关的特定表型，这些表型在之前的研究中未被发现。从机制上讲，MIPs被认为是CCDC146的主要靶标，它们在精子发生过程中调节轴丝的组织结构。因此，我们的发现扩展了我们对CCDC146在男性生殖中的认识，这可能为男性不育的病因和治疗提供有价值的信息。

致谢

我们感谢四川大学分析与检测中心的袁桂萍在透射电子显微镜图像方面提供的帮助。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（编号81971433、82271749和82301807）的资助。

利益冲突

无。