《Fish & Shellfish Immunology》：DJ-1 regulates innate immune defense and antioxidant response against
Vibrio parahaemolyticus infection in the mud crab
Scylla paramamosain
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泥蟹DJ-1蛋白（SpDJ-1）克隆与功能分析显示其广泛组织表达，肝胰腺表达量最高，感染后显著上调。RNA干扰沉默SpDJ-1导致抗氧化酶Nrf2和CAT表达降低，MDA含量升高，并加剧弧菌感染后的细菌载量及泥蟹死亡率，提示SpDJ-1通过调控免疫应答和抗氧化通路增强抗感染能力。
程长虹|陈成豪|范思刚|马红玲|刘光新|邓一勤|姜建军|冯娟|郭志勋
中国水产科学院南海渔业研究所南海渔业资源开发与利用重点实验室，农业部与农村事务部，广州，510632，中国
摘要
DJ-1蛋白在转录调控、抗氧化应激反应和线粒体调节过程中发挥着关键作用。然而，其在甲壳动物先天免疫系统中的具体作用尚未明确。在本研究中，从泥蟹（Scylla paramamosain）中克隆了一个DJ-1基因，并将其命名为SpDJ-1。序列分析显示，SpDJ-1包含一个570个碱基对的开放阅读框（ORF），编码一个由189个氨基酸组成的多肽；值得注意的是，该蛋白含有一个保守的GATase1结构域。组织分布分析表明，SpDJ-1在泥蟹的所有检测组织中均广泛表达，其中在肝胰腺中的表达水平最高。SpDJ-1的表达在受到V. parahaemolyticus感染时显著上调。此外，通过RNA干扰技术体内敲低SpDJ-1后，Nrf2和CAT的表达水平降低，而p53的表达水平及MDA含量增加。进一步地，体内敲低SpDJ-1导致血淋巴中的细菌负荷增加，并在V. parahaemolyticus感染后泥蟹的死亡率升高。这些发现共同表明，SpDJ-1通过调节免疫反应和维持抗氧化活性，在泥蟹抵抗V. parahaemolyticus感染中起着重要作用。
引言
泥蟹Scylla paramamosain是一种具有商业价值的甲壳动物，分布于印度-西太平洋地区。由于其高市场需求，它成为水产养殖中最具经济价值的蟹类之一。中国的泥蟹年产量已超过158,000吨[1]。然而，这一生产规模仍不足以满足不断增长的消费市场需求。病原体（包括细菌和病毒）的频繁爆发损害了泥蟹的健康和存活，给中国带来了巨大的经济损失[2]、[3]。Vibrio parahaemolyticus已被确定为主要的致病因子，对泥蟹养殖造成了严重的经济损失[4]。与脊椎动物不同，甲壳动物仅依赖其先天免疫机制来抵御入侵的病原体。因此，深入了解先天免疫系统的分子机制，特别是其对细菌感染的反应，有助于开发有效的疾病控制策略。
DJ-1属于DJ-1/PfpI超家族，参与多种生物过程，如转录调控、抗氧化应激反应和线粒体稳态调节[5]。最初，DJ-1基因被鉴定为一个新的有丝分裂原依赖性癌基因，这突显了其与细胞增殖调控的早期关联[6]。此外，越来越多的证据将DJ-1与家族性帕金森病的发病机制联系起来[7]。从机制上看，DJ-1通过多种途径发挥抗氧化作用。它通过依赖三个氧化还原敏感半胱氨酸残基的机制清除活性氧（ROS）[8]。研究表明，DJ-1敲除会降低线粒体过氧化氢（H2O2）清除剂的活性[9]。DJ-1还通过上调Nrf2信号通路增强抗氧化能力，并刺激抗氧化基因（如超氧化物歧化酶）的表达，从而降低细胞内ROS水平[10]。它也是线粒体稳态的关键调节因子。先前的研究证明，DJ-1的缺失会导致线粒体功能障碍，表现为呼吸控制比率降低和线粒体膜电位受损[11]。此外，DJ-1在调节免疫和炎症反应中起着重要作用[12]。近年来，DJ-1在水生动物研究中受到了越来越多的关注。例如，DJ-1被用作检测鱼类中非诺酚诱导的氧化应激水平的生物标志物[13]。V. alginolyticus感染可诱导Litopenaeus vannamei中DJ-1的表达[14]。尽管已在几种甲壳动物中鉴定出DJ-1的同源物，但体内的功能验证尚缺乏，其在介导先天免疫和对抗病原体感染的抗氧化反应中的调控途径仍不清楚。
在本研究中，我们首先从泥蟹中克隆并表征了一个DJ-1基因（命名为SpDJ-1）。使用定量实时PCR（qRT-PCR）分析了SpDJ-1的组织分布和表达模式。此外，还研究了V. parahaemolyticus感染后泥蟹中SpDJ-1的时间表达谱，以探讨其与病原体挑战的潜在关联。为了验证SpDJ-1在V. parahaemolyticus感染期间的功能作用，进行了RNA干扰（RNAi）实验以沉默SpDJ-1。本研究将为了解SpDJ-1在甲壳动物中调节先天免疫防御V. parahaemolyticus感染的分子机制提供新的见解。
实验动物
实验动物
实验所用泥蟹的平均体重为25.2 ± 2.1克，来自中国广东省珠海市的一家商业水产养殖场。在正式实验之前，所有蟹类都经过了一周的适应期。在此适应期间，泥蟹被饲养在配备循环过滤系统的塑料水箱中，饲养用水为盐度为4 ppt、温度为26 ± 2.0 °C的循环海水。
SpDJ-1的分子特征
成功克隆并表征了SpDJ-1的全长cDNA序列，总长度为1,298个碱基对（bp）。SpDJ-1的完整开放阅读框（ORF）编码一个由189个氨基酸残基组成的蛋白质；该蛋白质的预测分子量为19.42千道尔顿（kDa），理论等电点（pI）为5.99（图1）。氨基酸多序列比对分析显示，SpDJ-1含有1型谷氨酰胺氨基转移酶（GATase1）结构域。
讨论
DJ-1已被证实具有多种生物功能，包括转录调控、抗氧化应激反应、蛋白酶活性和线粒体调节功能[9]、[11]。然而，DJ-1在甲壳动物中的功能作用和分子特性仍不明确。在本研究中，成功克隆并鉴定了来自泥蟹的DJ-1基因。SpDJ-1的ORF长度为570 bp，编码一个由189个氨基酸组成的多肽。
结论
在本研究中，我们成功表征了来自泥蟹的DJ-1基因，并观察到其在V. parahaemolyticus感染后表达显著上调。体内敲低SpDJ-1后，nrf2的表达水平降低，MDA含量增加。此外，体内敲低SpDJ-1导致V. parahaemolyticus感染后泥蟹的细菌负荷和死亡率升高。这些结果共同表明，SpDJ-1参与了
CRediT作者贡献声明
程长虹：概念构思、方法学设计、实验实施、初稿撰写。陈成豪：资源获取、数据验证、正式分析。范思刚：实验实施、数据管理、数据可视化。马红玲：实验实施、数据管理。刘光新：方法学设计、数据验证。邓一勤：资源获取、正式分析。姜建军：实验实施、数据可视化。冯娟：资源提供、监督。郭志勋：概念构思、监督、资金获取、修订及
利益冲突声明
作者声明与本研究无利益冲突。我们声明与所提交的工作无关任何商业或关联利益。
致谢
本研究得到了海南省自然科学基金创新团队建设项目（项目编号：326MS0349）、南沙群岛珊瑚礁生态系统国家观测研究站（NSICR24102）、广东省现代农业产业技术体系（2024CXTD25）、广东省基础与应用基础研究基金（项目编号：2024A1515240032）以及通过引入科技促进城乡和区域协调发展专项的支持。
