参与日本比目鱼（Paralichthys olivaceus）炎症调节的胞外5’-核苷酸酶（CD73）的特性研究

《Fish & Shellfish Immunology》：Characterization of ecto-5’-nucleotidase (CD73) involved in inflammatory regulation in Japanese flounder ( Paralichthys olivaceus)

CD73同源基因PoCD73在炎症调控中的作用及调控机制研究。通过RACE-PCR和基因组步查鉴定PoCD73，发现其表达受ACOD1/itaconate途径调控，并确定-1/-215区域为核心启动子，SP1转录因子参与调控。药理学抑制和过表达实验证实PoCD73通过生成腺苷抑制LPS诱导的IL-1β、IL-8和TNF-α表达，揭示其在鱼类炎症中的负调控作用。

　　

作者：李硕、张瑶、张彤彤、王佳颖、孙金生

天津师范大学生命科学学院动物与植物抗性重点实验室，中国天津市西青区滨水西路393号，邮编300387

摘要

外切5’-核苷酸酶（CD73）是一种质膜糖蛋白，通过在哺乳动物的细胞外环境中生成抗炎信号分子腺苷来调节炎症。然而，CD73在低等脊椎动物中的表达和免疫功能仍不清楚。在本研究中，我们通过RACE-PCR和基因组walk技术鉴定了日本比目鱼（Paralichthys olivaceus）中的CD73同源物，将其命名为PoCD73。PoCD73基因包含9个外显子，编码一种具有与哺乳动物对应物相似结构特征的糖基化蛋白。PoCD73的表达在LPS刺激和Edwardsiella piscicida感染下显著增强。值得注意的是，PoCD73的表达还受到aconitate脱羧酶1（ACOD1）/itaconate途径的调控，该途径已被证明可以抑制鱼类由炎症刺激引起的促炎反应。此外，删除PoCD73的近端启动子区域（-1/-215）显著降低了其启动子活性，表明该区域是调控PoCD73基因表达的核心区域。我们还发现转录因子SP1在调控PoCD73转录中起作用。最后，药理学抑制PoCD73显著上调了比目鱼HKMs中的LPS诱导的IL-1β、IL-8和TNF-α表达；相反，在比目鱼FG-9307细胞中过表达PoCD73则显著降低了LPS诱导的TNF-α表达。综上所述，我们的研究确立了ACOD1/itaconate免疫代谢途径作为CD73表达的新调控因子，并阐明了外切核苷酸酶CD73在日本比目鱼炎症反应中的免疫调节功能。

引言

嘌呤能信号传导精细调节免疫细胞功能并调控宿主的炎症反应。细胞外ATP（eATP）和腺苷（eADO）是炎症研究中最为广泛研究的嘌呤能信号介质[1]、[2]、[3]。eATP通过激活免疫细胞上的特定ATP门控P2X受体产生促炎效应[4]。相反，eADO作为eATP的分解产物，通过激活腺苷受体介导的嘌呤能信号传导保护细胞和组织免受过度活跃的免疫反应造成的损伤[5]、[6]。例如，在受伤的鲤鱼皮肤中观察到腺苷水平升高，腺苷激活的A2受体被认为在伤口修复中起作用[7]。此外，eADO抑制促炎细胞因子的表达，同时上调抗炎细胞因子的表达[8]。eADO处理还能降低鲤鱼巨噬细胞中的iNOS基因表达和酶活性，从而减少炎症介质一氧化氮的水平[8]、[9]。这些发现突显了eADO在低等脊椎动物炎症调节中的重要性。然而，负责生成eADO的酶的特性和调控机制在鱼类中仍大部分未被探索。

eAdo是通过两步酶促过程从eATP生成的。首先，eATP在Ca2+和Mg2+依赖的情况下被外切核苷三磷酸二磷酸水解酶-1（ENTPD1，也称为CD39，EC 3.6.1.5）脱磷酸化为腺苷单磷酸（AMP）[10]。随后，AMP进一步被外切5’-核苷酸酶（NT5E，也称为CD73，EC 3.1.3.5）脱磷酸化为腺苷，腺苷具有强大的免疫抑制作用[11]。CD73是一种具有糖基磷脂酰肌醇（GPI）翻译后修饰的质膜糖蛋白，在炎症调节中通过生成免疫抑制性的eADO发挥关键作用[11]。因此，外切核苷酸酶CD39和CD73作为关键的“细胞外主开关”协同作用，塑造炎症微环境并维持炎症稳态[12]。在日本比目鱼（Paralichthys olivaceus）中，CD39已被证明在头部肾脏巨噬细胞（HKMs）中功能表达并负调控促炎反应[14]、[15]、[16]。

CD73已被证明在调节宿主-病原体相互作用[17]和哺乳动物的炎症[18]中发挥关键作用。例如，CD73缺陷小鼠在LPS处理后表现出更强的炎症反应和更多的促炎细胞因子产生[11]、[19]。此外，在Salmonella enterica感染的RAW264.7巨噬细胞或小鼠腹膜巨噬细胞中下调或抑制CD73会导致促炎细胞因子和一氧化氮的产生增加，从而增强杀菌活性[20]。CD73还限制多形核白细胞的迁移，同时增强其对Streptococcus pneumoniae的杀菌活性[21]。CD73生成的腺苷也参与防御细菌定植和感染[22]。最近的研究表明，CD73通过抑制星形胶质细胞中的GSDMD介导的焦亡来保护神经元免受炎症损伤[23]。尽管CD73在哺乳动物中的免疫调节作用已被证实，但其在硬骨鱼类中的表达和免疫学意义仍大部分未被探索。

在本研究中，我们从日本比目鱼Paralichthys olivaceus中鉴定并表征了CD73的同源物PoCD73。我们首次证明硬骨鱼类的CD73基因表达受到aconitate脱羧酶1（Acod1）/itaconate免疫代谢途径的调控。通过基因组walk和双荧光素酶报告基因实验，我们确定了PoCD73的核心启动子区域，并发现了转录因子SP1在调控鱼类CD73表达中的潜在作用。通过药理学抑制和过表达实验，我们还揭示了CD73在减轻鱼类LPS诱导的促炎反应中的作用。这些发现加深了我们对鱼类eATP-CD39-CD73-eADO免疫级联反应的理解。

主要头部肾脏巨噬细胞（HKM）的制备和培养

主要头部肾脏巨噬细胞（HKMs）的制备和培养方法如前所述[15]。FG-9307细胞系来源于Paralichthys olivaceus的鳃组织，在含有10%胎牛血清的MEM培养基中于21°C和2.5% CO2条件下培养。

基因克隆和基因组walk

为了获得全长PoCD73 cDNA，首先使用表1中列出的特异性引物对从Paralichthys olivaceus头部肾脏组织中扩增了一个内部片段。基于该序列，设计了正向引物CD73-F1、CD73-F2等。

PoCD73与其哺乳动物同源物的结构相似性

PoCD73基因长约7 kb，包含9个外显子和8个内含子（图1A）。通过RACE-PCR获得的全长PoCD73 cDNA为2358 bp，包括215 bp的5’非编码区、1752 bp的开放阅读框和391 bp的3’非编码区。比较PoCD73与其哺乳动物和其他鱼类物种的同源物发现，所有CD73基因都包含9个外显子和8个内含子，起始密码子和终止密码子分别位于第一个和第九个外显子中。

讨论

我们之前的研究表明，鱼类免疫细胞在炎症刺激和细菌感染时释放的细胞外ATP（eATP）会强烈激活鱼类巨噬细胞的促炎反应[31]。然而，由eATP引起的过度活跃和持续的免疫反应可能导致严重的组织损伤，甚至在密集培养条件下导致鱼类大量死亡。为了维持免疫稳态，eATP在细胞外依次被水解为腺苷

数据可用性声明

所有数据均包含在文章和补充材料中。

作者贡献声明

李硕：负责监督、概念构思、实验设计、数据分析、原始稿撰写、审阅和编辑。张瑶、张彤彤和王佳颖：负责数据管理、方法设计、实验实施和数据分析。孙金生：负责资源协调和项目管理。所有作者均阅读并批准了最终稿件。

利益冲突声明

作者声明本研究未涉及任何可能构成利益冲突的商业或财务关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：31572645）和天津市高校创新研究团队计划（项目编号：TD13-5076）的支持。