《International Journal of Biological Macromolecules》：Unraveling the NMR structures of G-quadruplex-forming aptamers acting as inhibitors of High Mobility Group Box 1 (HMGB1) pathological activity
编辑推荐：
为揭示可特异性靶向抑制HMGB1蛋白的G-四链体形成适配体的三维结构，本研究利用核磁共振(NMR)技术，结合尺寸排阻高效液相色谱(SE-HPLC)和圆二色光谱(CD)，深入解析了高活性适配体L12和L41在模拟生理离子条件下的折叠构象，明确了其偏好形成hybrid-2型单体G-四链体结构，并发现HMGB1对L12更高的亲和力与其在模拟胞外环境(PBS)中hybrid-2型折叠丰度更高相关，为设计更有效的HMGB1抑制剂提供了重要的结构基础。
在炎症、自身免疫性疾病和癌症的发生发展中，高迁移率族蛋白B1 (High Mobility Group Box 1, HMGB1)扮演着一个关键而复杂的角色。它通常在细胞核内充当DNA伴侣蛋白，但当被主动分泌或因细胞损伤而被动释放到细胞外时，就会“变身”为一种强效的促炎细胞因子，像一个警报信号，驱动免疫细胞的募集和活化，并促进肿瘤的生长、血管新生和转移。因此，靶向并抑制HMGB1的病理活性，成为治疗这些疾病极具前景的新策略。核酸适配体(Aptamer)是一种能高亲和力、高特异性结合靶标分子（如蛋白质）的单链DNA或RNA分子，被誉为“化学抗体”。它们具有合成方便、免疫原性低、易于修饰等优点。最近，研究人员从富含鸟嘌呤(G)的寡核苷酸文库中筛选出一系列能够特异性结合并抑制HMGB1的DNA适配体，其中L12和L41表现出最强的亲和力和抑制细胞迁移的能力。有趣的是，这两个适配体都能折叠成一种特殊的DNA二级结构——G-四链体(G-quadruplex)。这种结构由富含G的序列在金属阳离子（如K+、Na+）存在下，通过G-四联体(G-quartet)的层层堆叠而形成。G-四链体具有不同的拓扑构型（如平行、反平行、混合型），其结构细节直接影响着与靶蛋白的识别和结合。然而，尽管已知L12和L41有效，但它们究竟折叠成何种精确的三维结构？其结构特征如何影响它们与HMGB1的相互作用和抑制效力？这些问题尚不清晰，阻碍了基于结构的理性药物设计与优化。为此，由Marko Trajkovski、Chiara Platella、Domenica Musumeci、Ettore Napolitano、Carla Lucia Esposito、Silvia Catuogno、Janez Plavec和Daniela Montesarchio组成的研究团队，在《International Journal of Biological Macromolecules》上发表了他们的研究成果，旨在运用高分辨率核磁共振技术，揭开这两个明星适配体的结构面纱。
为了深入解析L12和L41适配体的结构，研究人员综合运用了多种生物物理和生物化学技术。首先，他们合成了适配体L12 (序列：5‘-d(TTA-GGG-ATT-GGG-AAT-GGG-TAT-GGG-TT)-3’)和L41 (序列：5‘-d(TTA-GGG-AAA-GGG-TAT-GGG-AAA-GGG-TT)-3’)，并通过尺寸排阻高效液相色谱(SE-HPLC)分离了它们在磷酸盐缓冲液(PBS)中形成的单体与多聚体物种。核心的结构解析工作依赖于核磁共振波谱学(NMR)，在模拟细胞内高K+环境（20 mM KPi缓冲液，100 mM KCl）下，对适配体单体进行了高分辨率的溶液结构测定。这包括使用1H NMR监测离子滴定下的结构形成与变化，通过位点特异性13C/15N同位素标记的样品进行二维异核单量子相干谱(HSQC)实验，从而完成化学位移的全归属，并借助二维核欧沃豪斯效应谱(NOESY)获取距离约束，最终通过模拟退火计算得到三维结构模型。圆二色光谱(CD)被用于监测不同离子条件（Na+或K+）下适配体的折叠拓扑类型和热稳定性。生物层干涉技术(BLI)用于定量测定单体L12和L41与HMGB1蛋白在PBS缓冲液中的平衡解离常数(KD)。最后，利用A549非小细胞肺癌细胞进行了体外细胞迁移实验（Boyden小室法），以验证L12和L41单体抑制HMGB1诱导的细胞迁移的能力。
NMR表征及SE-HPLC/CD分析抗HMGB1适配体L12和L41
研究人员首先发现，在模拟胞外环境的PBS缓冲液中，L12和L41单体与多聚体的1H NMR谱分辨率较低，无法进行精细结构解析。因此，他们转向了只含Na+或K+的简化缓冲体系。
在含Na+缓冲液中研究L12适配体：在Na+存在下，L12仅能部分折叠（约20-30%），形成一种热稳定性较低（熔解温度Tm约27°C）的G-四链体。CD谱在295 nm处的特征峰表明其为反平行(antiparallel)拓扑。扩散排序谱(DOSY)显示其平移扩散系数小于随机 coil 状态，证实了更紧凑的折叠。
在含K+缓冲液中研究L12适配体：K+能有效诱导L12形成结构明确、热稳定高（Tm约55°C）的G-四链体。通过系统的NMR分析（包括同位素标记、NOESY等），研究人员成功解析了其主要折叠形式（约占80-90%）的高分辨率溶液结构。该结构是一个单体分子内折叠的hybrid-2型G-四链体，包含三个G-四联体。其糖苷键扭转角呈现特定的模式：五个G（G4, G10, G11, G16, G22）为顺式(syn)，其余为反式(anti)。结构显示5‘端的T1-T2-A3与侧环A13-A14-T15存在动态相互作用，可能形成瞬时的A3:T15反向沃森-克里克碱基对，与G-四联体核心一起构成了一个“帽子”结构。
在含Na+或K+缓冲液中研究L41适配体：L41在K+存在下也能形成热稳定性高（Tm约53°C）的hybrid-2型单体G-四链体，其整体折叠拓扑与L12非常相似。关键区别在于L41的A19也呈现syn构象，且其3‘端和对应的侧环结构动态性有所不同。在Na+存在下，L41同样主要以随机 coil 形式存在，仅能形成少量低稳定性的G-四链体。值得注意的是，比较两者在PBS中的CD谱发现，L12形成hybrid-2型结构的程度高于L41，而L41中随机 coil 构象的比例更高。研究人员推测，这可能与L41序列中含有两个连续的AAA（全嘌呤）三碱基环有关，这种结构在低K+环境下可能更倾向于稳定随机 coil 中的嘌呤堆叠，从而抑制G-四链体的形成。
CD和BLI结合研究L12和L41适配体与HMGB1的相互作用
CD结合实验表明，当L12或L41单体与HMGB1在PBS中混合后，CD谱在200-230 nm区域（主要反映蛋白质构象）发生显著变化，而在230-320 nm区域（主要反映DNA结构）变化不大。这说明适配体与蛋白结合后，HMGB1的构象发生了重排，而适配体自身的G-四链体核心结构保持相对稳定。BLI定量分析给出了关键的亲和力数据：L12与HMGB1的KD值为220 ± 10 nM，而L41的KD值为663 ± 13 nM，表明HMGB1对L12的亲和力约为L41的3倍。
体外细胞迁移实验
在A549非小细胞肺癌细胞迁移实验中，100 nM浓度的L12和L41单体均能显著抑制由血清（含HMGB1）诱导的细胞迁移。其中，L12的抑制效果显著强于L41，这与BLI测得的更高亲和力结果一致。一个不能形成G-四链体的乱序序列(scr)则没有抑制作用，证明了G-四链体结构对于生物活性的必要性。
综上所述，本研究通过整合NMR、CD、SE-HPLC、BLI和细胞功能实验，系统阐明了两个高效抗HMGB1适配体L12和L41的精细三维结构及其与功能的关系。研究的核心结论与重要意义在于：
首先，研究成功解析了L12和L41在生理相关离子条件下（高K+）单体形式的高分辨率NMR结构，明确二者均偏好折叠为hybrid-2型G-四链体。这是首次对这些有治疗潜能的HMGB1抑制剂进行如此深度的结构阐明。
其次，通过交叉对比不同缓冲条件下的数据，研究人员推断，在模拟胞外环境的PBS缓冲液中，L12和L41单体的主要折叠形式同样是这种hybrid-2型结构。这意味着NMR解析的结构很可能代表了它们在生理环境下与HMGB1相互作用的“活性构象”，为理解分子识别机制提供了直接模板。
第三，研究揭示了细微序列差异导致的结构与功能分化。尽管整体折叠相似，但L12在PBS中形成hybrid-2型结构的比例更高、更为稳定，而L41则因含有连续的嘌呤环，在低K+环境下更易以随机 coil 形式存在。这直接导致了二者与HMGB1亲和力的差异（L12的KD比L41低3倍）以及体外抑制细胞迁移效力的差异（L12更强）。
最后，也是最重要的一点，该研究将结构、亲和力与生物活性成功关联。结果表明，HMGB1对hybrid-2型G-四链体折叠具有识别偏好，而L12正是因为在PBS中能形成更多此类结构，从而表现出更优的结合与抑制性能。这一发现超越了简单的活性比较，从构象偏好性的角度为差异提供了分子层面的解释。
因此，这项工作不仅增进了对HMGB1与其核酸配体相互作用机制的基础理解，更重要的是，它为基于结构的理性药物设计铺平了道路。所获得的精细三维结构信息，如同提供了精确的“作战地图”，使得科学家能够有针对性地对L12/L41的序列进行改造和优化，例如修饰其环区以增强在胞外环境下的折叠稳定性或改善药代动力学性质，从而设计出下一代更高效、更特异的HMGB1靶向治疗药物，为对抗炎症、癌症等相关疾病提供了新的工具和希望。
