《International Journal of Pharmaceutics》：Oleic acid-based formulation enables drug delivery of bRo5 compounds through intestinal lymphatic absorption
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bRo5药物通过淋巴吸收的机制研究显示，脂溶性药物（logP>5）在oleic acid诱导的乳糜微粒形成中结合更紧密，且在淋巴管 cannulated大鼠模型中，脂质制剂（如含10%成分的配方）可使Bcl-2和伊曲康唑的淋巴/血浆浓度提高3-5倍，证实药物脂溶性及制剂技术对淋巴吸收的关键作用。
Felicitas A. Jentschura|Laura Breidenbach|Mario Mezler|Mirko Koziolek|Dong Ye
分子谱型分析与药物递送、合成分子临床研发，AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG，Knollstrasse，Ludwigshafen 67061，德国
摘要
“超越规则5”（bRo5）化合物因其具有低水溶性和高脂溶性等特性而常常表现出有限的口服生物利用度。为了解决这一问题，人们开发了多种制剂技术来通过替代途径促进bRo5药物的吸收。其中，肠道淋巴吸收对于高脂溶性药物来说可能是最有效的方法之一，因为淋巴流动可以绕过首过代谢，从而提高口服生物利用度。
为了研究药物脂溶性如何影响淋巴吸收，我们建立了体外（in vitro）和体内（in vivo）模型，并研究了通过这种吸收途径的油酸摄取情况。在体内研究中，我们在大鼠体内建立了胸导管插管模型。使用含有油酸的脂质载体配方药物来调节淋巴吸收，并将其吸收能力与不含油酸的配方药物进行了比较。在体外实验中，我们使用油酸和牛磺胆酸钠（sodium taurocholate）诱导Caco-2细胞中的乳糜微粒（chylomicron）形成，并通过比较乳糜微粒的化合物渗透性与被大鼠淋巴系统吸收的药物比例来评估其替代效应。
实验结果表明，与非脂质配方相比，脂质配方中的Bcl-2化合物在体内的淋巴液和血浆中的浓度更高。来自乳糜微粒诱导的Caco-2细胞的脂溶性模型药物的渗透性与体内的淋巴吸收结果高度相关，这与使用logP值（>5）作为判断药物是否适合淋巴吸收的临界值所得到的结果相似。总体而言，本研究表明淋巴吸收与药物的脂溶性有关，且药物的生物利用度可以通过制剂方法和饮食中的脂质来影响。
引言
1997年，Lipinski提出了“规则5”原则，概述了药物实现适当口服生物利用度的物理化学要求（Lipinski等人，1997年）。这些要求包括分子量小于500 Da以及辛醇-水分配系数（logP）不超过5等有利特性。如今，对于那些传统上被认为难以成药的目标分子，制药行业正在探索应用违反这些规则的一种或多种规则的候选药物。这类化合物被称为“超越规则5”（bRo5）药物，它们通常具有较低的水溶性。其中一些化合物还具有高脂溶性，正如Charman及其同事所展示的那样，这可能导致药物吸收的显著差异。他们指出，高脂溶性药物可能不会直接进入全身循环，而是首先被淋巴系统吸收（Charman，2000年）。此外，对于logP > 5且溶解度大于50 mg/g的长链甘油三酯的药物，基于脂质的配方可以提供合适的制剂策略来提高口服生物利用度。然而，这也增加了利用肠道淋巴系统进行吸收的可能性（Charman和Stella，1986b；Trevaskis等人，2008年）。
在肠道内，食物中的膳食脂质在胃肠道的上皮细胞（肠细胞）中经历脂解并重新合成甘油三酯（TGs）。口服后，膳食脂质和脂溶性维生素首先在胃中被乳化，然后由胃脂肪酶启动脂解过程（Ros，2000年）。在十二指肠中，胆盐通过形成混合胶束进一步促进乳化。多种胰脂肪酶进一步水解这些脂质（Mansbach和Gorelick，2007年），生成游离脂肪酸和单酰甘油。此外，磷脂的消化也会产生游离脂肪酸和溶血磷脂（Phan和Tso，2001年）。胆固醇酯被分解成游离脂肪酸和游离胆固醇。这些产物被纳入胆盐胶束中，将脂肪酸和单酰甘油输送到肠微绒毛（Ros，2000年）。在通过细胞膜进行被动扩散或载体介导的运输之前，脂解产物会从胶束中分离出来（Hussain，2014年）。吸收机制取决于肠腔内的游离脂肪酸浓度；当浓度超过细胞内水平时，游离脂肪酸会穿过肠细胞膜；而较低的细胞外浓度则需要主动的蛋白质介导的运输（Iqbal和Hussain，2009年）。
在肠上皮细胞内，肠道脂肪酸结合蛋白将这些脂质分布到细胞质中的平滑内质网中，在那里甘油三酯被重新合成。在粗糙内质网中，这些重新合成的甘油三酯颗粒要么作为细胞内脂质颗粒储存，要么与由磷脂、载脂蛋白和胆固醇酯组成的“原始脂蛋白”结合（Trevaskis等人，2015年）。这些新形成的产物，也称为前乳糜微粒，在高尔基体中成熟并通过胞吐作用释放。成熟的乳糜微粒由甘油三酯和胆固醇酯核心以及磷脂、胆固醇和载脂蛋白表面组成（Ko等人，2020年），被肠系膜淋巴系统吸收并输送到胸导管，然后通过左静脉角进入血液。脂肪组织和肌肉组织中的脂蛋白脂肪酶分解乳糜微粒，释放出脂肪酸，这些脂肪酸随后被周围组织吸收（Ros，2000年）。
高脂溶性药物（通常logP > 5，TG溶解度 > 50 mg/g）也可以被整合到乳糜微粒中。它们通过乳糜微粒进入肠道淋巴管，从而直接进入血液，绕过了肝脏。这样，它们也避开了门静脉途径和肝脏的首过代谢（Trevaskis等人，2015年），使得淋巴吸收成为提高bRo5药物生物利用度的有效途径。尽管现在可以使用微创方法从人类身上采集淋巴液样本以评估淋巴成分和分子的淋巴吸收情况，但由于实验的可行性，动物模型或体外模型仍然被广泛使用（Zhang等人，2021年）。
胸导管插管及随后的淋巴液采样手术方法已在麻醉或清醒活动的大鼠以及猪、羊和狗等大型动物身上得到充分验证（Edwards等人，2001年）。虽然狗模型允许给予临床剂量，但大鼠模型便于与历史数据进行比较（Trevaskis等人，2005年；Choo等人，2014年）。乳糜微粒也可以从大鼠组织中分离出来，并用作与各种脂溶性药物（不同logP值）孵育的试剂。通过研究乳糜微粒与药物之间的结合程度，可以评估体外-体内相关性（IVIVC）以及大鼠插管淋巴生物利用度（Gershkovich和Hoffman，2005年）。
在Caco-2细胞中，使用富含油酸的配方（例如0.5 mM牛磺胆酸钠盐、1.6 mM油酸）来刺激乳糜微粒的形成，并以载脂蛋白（例如ApoB100和ApoB48）作为主要生物标志物（Luchoomun和Hussain，1999年；Ghoshal等人，2009年）来研究乳糜微粒的分泌和形成。研究表明，内质网中形成的富含甘油三酯的脂蛋白可以结合高脂溶性药物。通过高尔基体胞吐作用后，乳糜微粒-药物复合物被肠系膜淋巴系统吸收（Charman，2000年）。
在这项工作中，我们假设使用合适的脂质配方可以通过淋巴途径提高两种水不溶性药物（Bcl-2和伊曲康唑）的口服生物利用度。这两种分子属于bRo5类别，具有高分子量和血浆蛋白结合能力。鉴于淋巴吸收可能与药物的脂溶性相关，因此制剂方法和膳食脂质伴侣的使用可能会影响药物的口服生物利用度。油酸是一种不饱和的长链脂肪酸，已知它可以促进乳糜微粒的形成和淋巴运输，因此我们专注于使用油酸依赖的配方进行体外和体内实验。
在体内研究中，我们在大鼠体内建立了胸导管插管模型。通过使用脂质或非脂质载体来调节淋巴吸收，并比较了淋巴液和血浆样本中的药物浓度。在体外实验中，我们在经油酸处理的Caco-2细胞中诱导乳糜微粒的形成，并使用bRo5药物评估了CM（临床配方）在预测体内淋巴吸收方面的替代作用。
材料
Bcl-2化合物由AbbVie实验室（Abbott Park，IL）生产。除非另有说明，这些研究中使用的所有其他化合物均购自Sigma-Aldrich Chemie GmbH（Schnelldorf，德国）。Kolliphor EL购自BASF SE（Ludwigshafen，德国），二甲基亚砜（DMSO）和聚乙二醇400（PEG 400）也来自Sigma-Aldrich Chemie GmbH，而油酸则购自Lipoid GmbH（Ludwigshafen，德国）。
大鼠的淋巴导管插管
为了验证淋巴吸收研究的外科手术程序，我们在一只麻醉的大鼠体内进行了胸导管插管。该动物接受了溶解在橄榄油中的维生素D（0.5 mg/kg）口服剂量，以确认技术并评估淋巴吸收情况，然后再进行主要的体内实验。如补充图S2所示，维生素D3浓度在5小时内持续升高，最高浓度达到520.7 ng/mL。
讨论
药物的物理化学特性对药物吸收途径有显著影响（Trevaskis等人，2008年）。对于高脂溶性药物，淋巴吸收和运输尤为重要（Trevaskis等人，2015年）。在这项工作中，选择了Bcl-2和伊曲康唑作为bRo5模型药物，并通过口服给药给胸导管插管的大鼠，以确定吸收到淋巴系统的药物量，并评估其口服
作者贡献声明
Felicitas A. Jentschura：撰写 – 审稿与编辑、验证、方法学、数据分析、数据管理。Laura Breidenbach：撰写 – 审稿与编辑、监督。Mario Mezler：撰写 – 审稿与编辑、资源提供。Mirko Koziolek：撰写 – 审稿与编辑、资源提供。Dong Ye：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化处理、验证、监督、项目管理、方法学研究、数据分析、概念化。
利益冲突声明
作者声明以下可能构成潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Dong Ye与AbbVie Inc存在关系，包括就业和股权或股票。Felicitas A Jentschura与AbbVie Inc存在关系，包括就业和股权或股票。Laura Breidenbach与AbbVie Inc存在关系，包括就业和股权或股票。Mario Mezler与AbbVie Inc存在关系
致谢
所有作者衷心感谢AbbVie公司的Andreas Popp、Michaela Socher、Verena Lenz、Anita Wilhelm-Alkubaisi、Dominik Miltner、Franziska Hanke和Manuel Weiheimer在科研和技术支持方面的贡献。
