一种改进的分散固相萃取技术结合高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS/MS）方法，用于检测动物源性食品中的 difenoconazole、thiabendazole 及其代谢物

《Journal of Chromatography A》：An improved dispersive solid-phase extraction coupled with HPLC-MS/MS for the determination of difenoconazole, thiabendazole and their metabolites in animal-derived foods

动物源性食品中二苯吗啉酮和噻苯嗪及其代谢物的多残留分析技术研究。采用优化QuEChERS提取结合HPLC-MS/MS建立了同时检测二苯吗啉酮、噻苯嗪及其关键代谢物（二苯吗啉酮-醇和5-羟基噻苯嗪）的方法，在六类动物源性食品（猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉、鱼类）中验证，检出限0.3-2.0 μg/kg，加标回收率71.4%-104.9%，RSD 2.1%-9.8%，线性相关系数＞0.9993。方法成功应用于市场样本检测，为复杂基质中农药残留及代谢物风险控制提供技术支撑。

陈振鹏|黄民星|唐念|陈晓初|平昭华|王桂花|高玉峰

中国广东省科学院生物医学工程研究所分析与测试中心，广州510316。

摘要

食品动物中农药残留的生物转化和生物累积对动物源性食品的安全性构成了重大威胁。然而，传统的监测方法主要关注母体化合物，而其代谢物的相关风险往往被忽视。本研究开发并验证了一种灵敏的多残留检测方法，能够同时定量六种动物源性食品基质中的苯唑醇、噻苯达唑及其关键代谢物——苯唑醇醇和5-羟基噻苯达唑。分析过程首先使用改进的快速、简便、经济、高效、稳健且安全的（QuEChERS）方法从基质中提取分析物，然后通过HPLC-MS/MS进行测定。系统评估了影响提取效率的参数。在优化条件下，该方法的检测限（LOD）为0.3-2.0 μg kg^?1，定量限（LOQ）设定为最低添加水平2.0 μg kg^?1（苯唑醇醇的LOQ为5.0 μg kg^?1）。观察到良好的线性关系，相关系数大于0.9993。在六种基质（猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉和鱼肉）中验证了准确性和精密度，回收率介于71.4%至104.9%之间，相对标准偏差（RSD）在2.1%至9.8%之间。此外，该方法成功应用于市场样品中农药及其代谢物残留的测定，证实了其在复杂动物源性食品基质中的定量分析性能优异。

引言

近年来，随着畜牧业和家禽业的快速发展，动物源性食品在日常饮食中的比例逐渐增加，公众对其安全性的关注也随之提高[1,2]。动物源性食品的安全性受到多种因素的影响，如抗生素残留、重金属、有害微生物和农药残留。然而，农药残留最容易被忽视，因为只有少数农药直接用于动物病虫害控制，大多数农药是通过动物饲料间接引入并转化为难以检测的代谢物[3,4]。例如，苯唑醇广泛用于饲料作物的病害控制，而噻苯达唑常用于防止饲料成分发霉[5,6]。这些杀菌剂在饲料生产中的过度使用可能导致其在动物体内积累、迁移和代谢，从而通过食物链对人类健康构成风险[7]。因此，监测动物源性食品中的这些高风险杀菌剂残留并进行后续风险评估是确保食品安全的关键措施。

比较产品中的农药残留水平与规定的最大残留限（MRLs）为食品风险评估提供了科学可靠的方法[8,9]。由于苯唑醇和噻苯达唑残留可能对健康构成风险，食品法典委员会（CAC）分别为禽肉中的苯唑醇制定了0.01 mg kg^?1的MRL，为哺乳动物肉中的噻苯达唑制定了0.2 mg kg^?1的MRL[10]。此外，基于代谢研究还确定了需要在各种食品样品中监测的杀菌剂残留[11]。对于动物源性食品中苯唑醇和噻苯达唑的监测，残留定义包括母体化合物及其代谢物苯唑醇醇和5-羟基噻苯达唑（代谢途径和化合物结构见图S1）。然而，这些代谢物具有高脂肪溶解性、广泛的组织分布和持续的代谢转化，其在高脂肪动物源性食品基质中的鉴定和定量研究仍不足[[12], [13], [14]]。

目前的研究主要集中在苯唑醇和噻苯达唑的方法学研究上，已经开发了多种分析方法，如光学传感器[15]、电化学传感器[16]、表面增强拉曼散射（SERS）[17]、气相色谱-质谱（GC-MS）[18]和液相色谱串联三重四极杆质谱（LC-MS/MS）[19]。其中，配备有优异电离和分离系统的LC-MS/MS（如电喷雾离子化（ESI）源和高性能液相色谱（HPLC））被认为是同时定量杀菌剂的首选技术，因其分离效率高、分辨率精确、保留时间一致且选择性良好。例如，Souza[20]开发了一种用于牛奶中苯唑醇母体化合物的HPLC-MS/MS方法，而Martínez-Villalba[21]使用大气压电离模式的HPLC-MS/MS定量了19种苯并咪唑化合物，包括噻苯达唑及其代谢物5-羟基噻苯达唑。然而，这些基质的高脂肪含量使得由于代谢物的脂溶性和物理化学性质改变，提取代谢物时回收率难以达到满意水平。

分析动物源性脂肪食品中的微量化合物面临重大挑战，因为其基质复杂，有效去除共提取的脂质和蛋白质对于保持色谱性能至关重要[22,23]。已开发了多种预处理技术以减少农药残留分析中的基质效应[24,25]。例如，快速、简便、经济、高效、稳健且安全的（QuEChERS）方法是应用最广泛的提取技术之一[26]。该方法通过其可调节的提取和清洗系统能够在多种食品基质中检测农药残留[27]。通过将乙腈与有机酸、有机胺或溶剂结合，可以优化提取溶剂的pH值和极性，从而有效分离具有不同物理化学性质的分析物[28,29]。随后使用具有定制吸附性能或表面改性材料的吸附剂去除共提取的杂质[30,31]。在这方面，将改进的QuEChERS方法与HPLC-MS/MS结合使用被证明是同时测定复杂动物源性产品中杀菌剂及其代谢物的最佳技术。

本研究旨在利用改进的QuEChERS样品制备方法，通过HPLC-MS/MS开发一种方便、高效且高度准确的分析方法，用于同时测定动物源性食品中的母体杀菌剂（苯唑醇和噻苯达唑）及其代谢物（苯唑醇醇和5-羟基噻苯达唑）。通过单因素优化实验开发了改进的QuEChERS提取和清洗系统，系统比较和优化了关键实验参数，包括仪器条件、提取溶剂和吸附剂。该方法在六种代表性动物源性食品基质（猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉和鱼肉）中进行了定量分析，并评估了线性、准确性、精密度和灵敏度。此外，还在实际样品中测定了苯唑醇、噻苯达唑及其代谢物，证明了该方法的有效性。

材料与试剂

苯唑醇、苯唑醇醇、噻苯达唑和5-羟基噻苯达唑的认证参考标准品购自Sopo Biotechnology（中国广州）。色谱级溶剂（乙腈、甲醇、丙酮）购自Thermo Fisher Scientific（中国）。十八烷基硅烷（C18）和一级胺（PSA）吸附剂分别购自Agela Technology（天津，中国）和Anpel Laboratory Technology（上海，中国）。超纯水

目标分析物的选择

经济合作与发展组织（OECD）制定了农药残留定义的指导原则，为残留物的鉴定提供了统一方法。农药残留是指农药及其代谢物、降解产物和其他存在于或附着在食品上的转化产物的组合。在开发用于风险评估或MRL执行的监测方法时，应特别关注残留物的组成和水平

结论

本研究提出了一种灵敏且经过验证的方法，使用HPLC-MS/MS和改进的QuEChERS样品制备方法，同时定量六种动物源性食品基质（猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉和鱼肉）中的母体杀菌剂（苯唑醇和噻苯达唑）及其关键代谢物（苯唑醇醇和5-羟基噻苯达唑）。通过全扫描质谱和电离条件的优化，实现了

作者贡献声明

陈振鹏：正式分析、实验研究。黄民星：实验研究、方法学研究。唐念：数据管理、实验研究。陈晓初：概念构思、资金获取、实验研究、初稿撰写。平昭华：项目监督、项目管理。王桂花：资源调配、项目监督、审稿与编辑。高玉峰：项目管理、方法验证、项目监督。

资助

本研究得到了广东省基础与应用基础研究基金（项目编号2023A1515010998）和广东省科技发展计划（项目编号2023GDASZH-2023030602、2022GDASZH-2022030603-01）的支持

作者贡献声明

陈振鹏：实验研究、正式分析。黄民星：方法学研究、实验研究。唐念：实验研究、数据管理。陈晓初：初稿撰写、实验研究、资金获取、概念构思。平昭华：项目监督、项目管理。王桂花：审稿与编辑、项目监督、资源调配。高玉峰：方法验证、项目监督。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。