芳香笼功能化多孔分离材料：设计、合成及其在从人血浆中选择性提取克罗顿酰化蛋白质中的应用

《Journal of Chromatography A》：Aromatic Cage-Functionalized Porous Separation Material: Design, Synthesis and Application in Selective Extraction of Crotonylated Proteins from Human Plasma

丙二酰化蛋白质选择性分离材料开发及SPE-HPLC-MS检测方法研究。通过修饰4-tert-丁基calix[4]arene单体构建多孔芳香族聚合物材料，利用其YEATS域类似结构实现丙二酰化蛋白质的高效捕获。结合固相萃取与高效液相色谱串联质谱分析，在动脉粥样硬化患者和健康志愿者血浆中分别检测到8和25种丙二酰化蛋白质，显著优于传统亲和方法。材料具有多级孔道结构、高比表面积和生物相容性，通过疏水作用、氢键、π-π堆积及偶极-偶极相互作用增强选择性。

卢思楠|杨新丽|韩思良|张航|袁雅楠|白立盖

河北大学药学院，河北省药物质量控制重点实验室，教育部药物化学与分子诊断重点实验室，国家新药制剂与辅料重点实验室，保定，071000，中国

摘要

蛋白质的肉桂酰化是一种关键的翻译后修饰，与包括动脉粥样硬化在内的多种疾病的发病机制密切相关。由于它具有作为生物标志物或治疗靶点的潜力，因此迫切需要敏感且特异的检测方法。然而，由于肉桂酰化蛋白在人血浆中的含量较低且存在严重的基质干扰，直接分析这些蛋白存在困难。受YEATS结构域通过其芳香笼结构精确识别肉桂酰化蛋白的启发，我们开发了一种多孔芳香笼功能化的分离材料，该材料以经过修饰的4-叔丁基杯[4]芳烃作为单体。通过共聚反应，这种材料被制成聚合物整体柱，利用多 site 协同作用（疏水效应、氢键、π-π 堆叠和偶极-偶极相互作用）实现了对肉桂酰化蛋白的选择性识别。该材料具有层次化的孔结构、高比表面积和优异的生物相容性，从而能够高效地进行质量传递并与肉桂酰化蛋白特异性结合。结合 Bio-C18 柱，我们建立了一种 SPE-HPLC-MS 方法，用于从人血浆中选择性提取和检测肉桂酰化蛋白。对于动脉粥样硬化患者和健康志愿者的血浆，该方法分别在 10′ 和 7* 色谱分段中检测到了 8 种和 25 种肉桂酰化蛋白——这比仅使用 Bio-C18 分离后进行 MS 分析或直接 MS 分析的结果更多。与传统的基于蛋白质配体的亲和方法相比，我们的方法消除了复杂的配体偶联步骤，并通过识别位点的共价结合提高了稳定性和重复性。

引言

肉桂酰化是一种最近发现的翻译后蛋白质修饰，已成为调节细胞生理的关键因素，通过专门的读取蛋白调控多种生物过程[1]。这种动态修饰的特点是赖氨酸的肉桂酰化（Kcr）的共价连接，与基本的细胞功能以及包括心血管疾病、恶性肿瘤和代谢综合征在内的主要疾病的发病机制密切相关[2,3]。肉桂酰化的可逆性使其具有作为诊断生物标志物和治疗靶点的独特潜力，使其成为转化医学研究的前沿[4,5]。值得注意的是，尽管其生物学意义重大，但在翻译后修饰的研究领域中，肉桂酰化仍是一个相对未被充分探索的领域。由于其研究历史较短，我们对其在体内的作用机制、功能影响和与疾病相关的网络了解不足。因此，开发从血液样本中分离和表征肉桂酰化蛋白的方法至关重要。这一技术挑战具有双重必要性：首先，需要采用高选择性的提取技术从复杂的生物混合物中分离出肉桂酰化蛋白。包括基于亲和力的纯化和先进的色谱方法在内的最新技术[6,7]已被证明在实现目标富集方面非常有效，且背景干扰最小。其次，需要实施超灵敏的分析平台来验证修饰的发生、量化化学计量比并确定修饰位点[8]。质谱（MS）凭借其无与伦比的灵敏度和结构分辨率，已成为表征肉桂酰化蛋白质组的黄金标准[9]，能够精确注释修饰残基、进行定量分析以及网络级相互作用分析。

然而，直接对生物样本进行 MS 分析受到肉桂酰化蛋白含量低、非目标蛋白质组背景强烈以及信号抑制效应的限制。这些限制要求整合复杂的样品预处理策略。其中，固相萃取（SPE）与高效液相色谱（HPLC）的结合已成为一种关键技术[10,11]。SPE 利用疏水、离子或亲和相互作用来富集肉桂酰化蛋白[12]，而 HPLC 则基于分析物的理化性质进行分离[13,14]。这种耦合技术不仅减轻了基质效应，还提高了 MS 的检测能力，为低丰度分析物的分析提供了协同解决方案[15]。

该领域的持续发展取决于下一代 SPE 材料的合理设计，这些材料需要能够特异性识别肉桂酰化蛋白。多孔有机聚合物具有较大的通孔，适合大分子的通过；它们还表现出优异的生物相容性，确保不会损坏生物样本，因此成为选择性捕获的有希望的支架[16,17]。特别值得关注的是基于杯[4]芳烃的材料，其杯状腔体通过多种相互作用（包括疏水效应、氢键、π-π 堆叠和偶极-偶极相互作用）实现肉桂酰化基团的大小和形状选择性识别[[18], [19], [20], [21], [22], [23]]。这种结构多样性使杯[4]芳烃衍生物成为解决高保真度肉桂酰化蛋白分离需求的理想候选者。

因此，设计和合成一种同时具有疏水口袋和芳香笼结构的多孔聚合物整体分离介质是一种有吸引力的策略。这样的设计不仅利用了多孔整体材料的固有优势，还充分利用了这些结构 motif 对肉桂酰化的特异性识别。这种双重功能方法提高了目标识别的成功率，显著增强了分离方法的特异性，使其成为分离肉桂酰化蛋白的理想介质。

在这项工作中，受 YEATS 结构域通过芳香笼结构精确识别肉桂酰化蛋白的体内机制的启发，我们将经过修饰的 4-叔丁基杯[4]芳烃（具有圆锥形杯状构象）引入聚合物整体分离介质的制备中。通过超分子相互作用，这种设计实现了对肉桂酰化蛋白的选择性识别，从而能够从血液样本中将其选择性提取。这些发现为在生物基质中高效分离和精确鉴定肉桂酰化蛋白提供了坚实的方法论框架，为后续的蛋白质组学研究建立了可靠的基准，并为阐明其在疾病中的作用提供了强大的工具。

材料设计与合成

杯[4]芳烃下缘的羟基团是化学修饰的活性位点。通过引入丙烯酰氯，我们获得了一种在下缘带有末端双键的可聚合单体，其合成路线如图 S1（支持信息文件）所示。具体步骤如下：将 2.0 克杯[4]芳烃、3.0 毫升三乙胺和 40 毫升混合溶剂（DMF-THF，2:1，V/V）依次加入一个 250 毫升的三颈烧瓶中

分离材料的表征

通过优化分离材料的制备条件，我们选择了结构适中且性能良好的材料 A2 用于后续研究。图 2（A-E）依次显示了该材料的扫描电子显微镜图像、红外光谱、氮吸附-脱附等温线、介孔尺寸分布和宏观孔尺寸分布。从图中可以看出，材料 A2 是从杯[4]芳烃衍生物成功合成的。

结论

本研究合成了一种受 YEATS 结构域核心结构启发的多孔分离材料，该材料通过聚合经过修饰的 4-叔丁基杯[4]芳烃制备而成。这种分离材料表现出从人血浆中选择性识别肉桂酰化蛋白的强大能力。这种特异性主要归因于末端开放的芳香笼结构，该结构能够通过靶向肉桂酰基团准确识别肉桂酰化蛋白。与传统亲和方法相比

资助

本研究得到了河北省教育厅科技项目（ZD2022079）和河北大学创新团队计划（IT2023A06）的支持。

CRediT 作者贡献声明

白立盖：概念构思、资金获取、项目管理、资源协调、监督、撰写-审阅与编辑；卢思楠：实验研究、方法学设计、数据分析、验证、可视化；杨新丽：撰写-初稿撰写、方法学设计、软件应用、数据管理。韩思良：提供临床血浆样本；张航：项目管理、方法学设计；袁雅楠：监督、撰写-审阅与编辑。

利益冲突

不存在利益冲突。

附录。

未引用的参考文献

[33,34]

CRediT 作者贡献声明

卢思楠：验证、方法学设计、实验研究、数据分析。 杨新丽：初稿撰写、软件应用、方法学设计、数据管理。 韩思良：验证、数据分析。 张航：审阅与编辑、数据管理。 袁雅楠：审阅与编辑、监督。 白立盖：审阅与编辑、监督、资金获取、概念构思。

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。