《Journal of Microbiological Methods》：Precision bacterial quantification via dual-enhanced U-net: Addressing division artifacts and spatial bias in microscopy analysis
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细菌定量高精度高通量方法研究。本研究提出基于改进U-Net模型的细菌高通量定量方法，创新性地结合面积归一化方法（ANM）解决分裂不完全的细菌粘连问题，以及多视角平均策略（MVAS）补偿空间分布不均问题。实验表明，该模型像素级分割准确率超过98%，Dice系数达83%，细菌计数相对误差从50%降至7%，与传统OD测量高度线性相关（R2=0.973），并准确反映细菌指数生长特性（R2=0.951）。
王子怡|徐伟|张琪|张宁|张强玲|鲍迅|梁曲|黄超群|褚艳楠|邹雪|沈成胤
中国科学院合肥物质科学研究院健康医学技术研究所，中国科学院合肥癌症医院，中国合肥230031
摘要
细菌定量是生物医学研究和临床诊断的基础。传统方法，如平板计数和光密度（OD）测量，受到时效性差和无法满足高通量应用需求的限制。尽管基于神经网络（NN）的光学显微镜图像分析能够快速计数细菌，但其计数精度仍然有限。在这里，我们开发了一个改进的基于U-Net的框架，其中包括两个关键的方法创新：（1）面积归一化方法（ANM），用于解决细菌分裂过程中分离不完全的问题；（2）多视图平均策略（MVAS），用于补偿空间分布不均匀的问题——这两种方法都是为了提高计数精度。优化后的U-Net模型对大肠杆菌（Escherichia coli）的像素级分割精度超过了98%，Dice相似系数（DSC）超过了83%。与我们基线神经网络性能相比，我们的ANM方法将细菌计数的相对误差（RE）从大约50%降低到了7%以下。将ANM和MVAS结合使用的双策略方法与传统的OD测量方法进行验证时，显示出强烈的线性相关性（R2 = 0.973）。在监测细菌增殖动态时，该方法表现出对指数生长模型的良好适应性（R2 = 0.951），能够准确捕捉细菌二分裂的特征。总之，本研究建立了一种高精度、高通量的细菌定量方法，可立即应用于实时微生物监测和可扩展的诊断工作流程中。
引言
细菌定量是生物医学研究和临床诊断的基础（Khan等人，2010年；Beal等人，2020年；Zhang等人，2022年；Meyer等人，2023年）。不准确的细菌定量可能导致对细菌生长状态的误解，从而影响抗菌药物敏感性测试（AST）的可重复性和解释性，并降低实时感染监测的可靠性（Egerv?rn等人，2007年；Turkeltaub等人，2024年）。传统的定量方法包括平板计数和光密度（OD）测量（Pan等人，2014年；Pe?uelas-Urquides等人，2013年；Ou等人，2017年；Lucidi等人，2019年；Martini等人，2024年）。平板计数方法被认为是细菌定量的金标准，它涉及记录培养基表面的菌落数量，然后根据稀释因子计算原始样本中的总细菌数量（Boulos等人，1999年；Ogawa等人，2012年）。尽管成本低廉，但菌落形成过程耗时较长，这影响了该方法的时间效率（Fournier等人，2013年；Franco-Duarte等人，2019年；Mkhwanazi等人，2024年）。OD方法通过测量微生物悬浮液的光吸收（OD值）来估计细菌数量，具有速度快和能够连续监测的优势（Begot等人，1996年；Myers等人，2013年）。然而，细菌数量与OD值之间没有普遍适用的线性关系，因此无法直接确定细菌浓度（Stevenson等人，2016年；Boss等人，2018年；Mira等人，2022年）。此外，这两种方法都不适合高通量细菌计数。
近年来，流式细胞术、基于阻抗的检测和荧光显微镜等技术越来越多地应用于细菌定量，一定程度上提高了分析精度和效率。然而，它们在常规微生物实验室中的广泛应用仍然受到限制。具体来说，流式细胞术可以实现快速定量分析，但通常依赖于昂贵的专用仪器，操作相对复杂，且通常需要受过培训的人员和专用试剂（Veal等人，2000年）。基于阻抗的方法对于复杂样本通常依赖于微流控设备或功能化电极平台，可能需要额外的分离或富集步骤（Chen等人，2023年）。荧光显微镜可用于细菌计数，但它通常依赖于荧光染色或标记程序，并且样品制备相对繁琐（Yamaguchi和Fujii，2020年）。在这种背景下，仍然需要一种无标记且成本效益高的细菌定量方法。
相比之下，基于图像的神经网络模型可以自动执行目标识别和分割。当与传统的光学显微镜结合使用时，它们可以在保持单细胞分辨率的同时实现高通量细菌计数，而无需依赖昂贵的专用计数仪器。因此，这种方法为常规实验室应用提供了强大的可扩展性和可访问性（Jia等人，2013年；Ferrari等人，2015年；Qin等人，2017年；Li等人，2017年；Kunzmann等人，2024年）。U-Net是一种专为生物医学图像分割设计的经典编码器-解码器卷积神经网络架构（Ronneberger等人，2015年）。其独特的U形对称结构和跳跃连接机制使其在像素级预测任务中表现出色。在这项研究中，U-Net被用作基线分割模型，其强大的特征提取能力和精确的边界定位被用来实现细菌图像的准确像素级预测。通过端到端训练，U-Net有效地学习了从输入图像到分割掩膜的复杂映射（Zhou等人，2018年；Falk等人，2019年；Ibtehaza和Rahmanb，2020年；Siddique等人，2021年；Shu等人，2024年）。该方法使用计算机视觉算法直接标记和分割显微镜视野（MFOV）中的细菌，比OD测量提供了更高的精度。此外，它消除了将细菌培养成菌落形式的需要，因此比平板计数方法更快。
现有的深度学习方法可以自动分割细菌显微镜图像，并且在结合后处理的情况下可以在一定程度上实现计数（Panigrahi等人，2021年；Spahn等人，2022年）。然而，当分裂后细菌分离不完全导致目标粘附或合并，以及空间异质性可能影响从局部视野到整个样本计数的外推时，仅依赖分割结果仍可能引入计数偏差和不确定性。先前的研究表明，分裂后的子细胞分离依赖于分裂部位的肽聚糖水解；在大肠杆菌（E. coli）中，这一过程的受损可能导致持续连接的菌链，反映出“分裂不完全”的形态（Priyadarshini等人，2007年；Yang等人，2011年）。我们在培养过程中也观察到了类似的现象，这表明这种形态特征可能会增加基于图像的细菌计数的复杂性。另一方面，先前的微孔板系统研究报道，微生物相关的生物量在孔内的不同区域可能存在空间不均匀性（Gomes等人，2014年；Kragh等人，2019年）。在我们的实验条件下，我们也观察到同一孔内不同显微镜视野之间的变异性（图4b）。这些观察表明，当从有限的显微镜视野推断整个样本的数量时，潜在的孔内空间异质性可能会引入采样不确定性，因此在推断和解释结果时应予以考虑。
在这项研究中，我们提出了一种基于神经网络建模的面积归一化方法（ANM）和多视图平均策略（MVAS），开发了一种更准确的高通量细菌计数方法。我们通过结合Cellpose（v2.0）和Labelme（v5.0）构建了一个数据集，并使用U-Net模型获得了细菌分割结果。为了解决细菌“分裂不分离”的问题，我们引入了ANM。它计算了培养皿中检测到的细菌的总像素面积，然后除以单个细菌的平均像素面积。这种方法提高了分割精度，确保了更可靠的细菌计数。为了解决细菌分布的异质性问题，我们实施了MVAS。它捕获了培养皿不同区域的图像，计算了每个MFOV中的细菌数量，然后通过加权平均计算总数。这种新开发的细菌定量方法既具有高精度又具有高通量，使其非常适合实时、快速监测细菌数量。
部分片段
样品制备
本研究中使用的阳离子调整的Mueller-Hinton肉汤（Cation-Adjusted Mueller-Hinton Broth，CAMHB）为分析级，购自青岛Hope Bio-Technology公司；大肠杆菌（E. coli）来自中国工业微生物菌种保藏中心（CICC）。激活后，将菌株划线接种到琼脂平板上进行分离，并在37°C下培养约14-16小时以获得单菌落。
从平板上挑选一个菌落并接种到Cation-Adjusted...
基于U-net的细菌分割
然后使用训练有素的U-Net模型对测试图像中的单个细菌进行分割。为了验证模型的准确性，使用同一图像的手动分割作为参考标准（图2b）。结果显示，U-Net生成的分割输出（图2c）与手动注释（图2d）有很强的重叠。此外，U-Net模型对选定图像的分割精度超过了98%（图2e），表明模型性能良好。此外，标准...
讨论
我们使用U-Net自动分割细菌显微镜图像，实现了98%的整体分割精度，表明其在我们的数据集上具有强大的性能和泛化能力。与之前的细菌图像分析深度学习工具一致，自动分割可以为下游计数和表型分析提供基础，从而实现更高通量的工作流程（Panigrahi等人，2021年；Spahn等人，2022年）。这些结果共同表明，我们的自动化...
结论
在这项研究中，我们开发了一种改进的基于U-Net的细菌定量方法，结合了MVAS以提高数据可靠性，并应用ANM对分割结果进行后处理。这种方法实现了高精度的细菌识别和分割。实验结果表明，该方法能够实现准确且高通量的细菌定量。
此外，所提出的方法在细菌形态上表现出泛化能力...
CRediT作者贡献声明
王子怡：撰写——原始草稿、方法论、研究、数据管理。徐伟：撰写——审阅与编辑。张琪：可视化、研究。张宁：验证、监督。张强玲：资金获取。鲍迅：概念化。梁曲：正式分析。黄超群：正式分析。褚艳楠：资金获取。邹雪：资金获取。沈成胤：资金获取。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（22376198和22306187）、中国科学院青年创新促进协会（Y2023122）、安徽省自然科学基金（2408085J020）、中国科学院科学仪器开发项目（PTYQ2025TD0004）、安徽省健康研究计划（AHWJ2024Aa10005）、中国博士后科学基金（2025M783646）和安徽省博士后科学研究计划的支持。
