《Journal of Pharmaceutical Analysis》：Aptamer-based nanoparticle drug delivery system designed for targeting GPC3-positive liver cancer
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为解决肝细胞癌(HCC)靶向治疗中因传统抗体免疫原性强、成本高等问题导致的疗效不足，研究人员通过DNA折纸技术构建了嵌合GPC3特异性适配体(AP613-1)的三角形单链DNA纳米结构(mTriangle-AP613-1)，并以此功能化装载阿霉素(DOX)的脂质体，开发了一种新型纳米药物递送平台。体内外实验结果表明，该系统能特异性靶向GPC3阳性肿瘤细胞，显著增强药物亲和力(KD=15.2 ± 0.21 nM)，并有效抑制肿瘤生长，为肝癌的精准治疗提供了新策略。
肝癌，尤其是肝细胞癌(HCC)，是全球范围内一个严峻的健康挑战，其发病率和死亡率居高不下。尽管传统的手术、放疗和化疗不断进步，但它们常常伴随着严重的毒副作用和缺乏对癌细胞的“精准”打击能力，导致“杀敌一千，自损八百”的局面。为了更聪明地对抗癌症，科学家们将目光投向了“靶向治疗”——即寻找癌细胞特有的“身份标签”，然后派送精确制导的“药物导弹”去定点清除。在HCC的众多潜在靶点中，Glypican-3 (GPC3)脱颖而出。这个细胞表面的糖蛋白在超过70%的HCC中过量表达，却在正常肝组织和良性病变中几乎不出现，堪称一个理想的“肿瘤标志物”。
然而，传统的靶向工具——抗体，虽然有效，但其“身材”庞大、生产成本高昂、批次间可能有差异，有时还会引起人体的免疫反应。有没有更小巧、更稳定、更经济的替代品呢？有的，那就是“适配体”(Aptamer)。适配体是人工筛选出的短链单链DNA或RNA分子，能够像抗体一样高特异性地结合目标，但拥有易于合成、修饰灵活、免疫原性低等诸多优点。本研究团队之前就筛选到了一个能特异性结合GPC3的DNA适配体，名为AP613-1。但适配体个头太小，在体内容易被快速清除，难以有效抵达肿瘤部位。如何让它变得“强大”又“持久”？
与此同时，DNA纳米技术，特别是DNA折纸(DNA origami)技术，为构建精密的纳米级结构提供了可能。而脂质体作为经典的药物载体，能包裹化疗药物，降低其全身毒性。如果能将这三者强强联合——用DNA折纸技术“武装”适配体，增强其稳定性和靶向能力，再将其“安装”到装载药物的脂质体上，不就能打造出一款智能的“抗癌纳米导弹”了吗？
为了验证这一构想，复旦大学附属中山医院肝癌研究所的研究团队在《Journal of Pharmaceutical Analysis》期刊上发表了一项创新性研究。他们成功构建了一种名为mTriangle-AP613-1-liposomes (DOX)的靶向纳米药物递送系统，用于治疗GPC3阳性的肝细胞癌。
主要技术方法
本研究整合了多项前沿生物技术。首先，利用噬菌粒-辅助噬菌体系统这一生物技术，大规模生产包含目标序列的长单链DNA。接着，采用DNA折纸技术，将GPC3靶向适配体AP613-1序列整合进一个能够自组装成三角形纳米结构(mTriangle-AP613-1)的长单链DNA骨架中，此过程利用了嵌入的自切割脱氧核酶(I-R1a) 来实现目标单链DNA的高效切割与释放。然后，通过薄膜水化法和挤出技术制备了由特定磷脂（DOPC, DOPE, DOPS等）组成的脂质体，并利用硫酸铵梯度法将抗癌药阿霉素(DOX)高效包载于脂质体内部。最后，通过等密度超速离心技术，实现了DNA纳米结构对脂质体按尺寸的辅助分选。靶向性和疗效评估则综合运用了表面等离子体共振(SPR) 测定亲和力、流式细胞术与共聚焦显微镜进行细胞靶向分析、CCK-8法检测细胞毒性，并在Huh-7细胞荷瘤裸鼠模型中进行了体内抗肿瘤药效与安全性评价。
研究结果
3.1. 催化DNA辅助的mTriangle-AP613-1生物技术生产
研究人员成功设计并生产了嵌合AP613-1适配体的三角形单链DNA纳米结构(mTriangle-AP613-1)。通过噬菌粒系统大规模生产前体单链DNA，并利用自切割脱氧核酶将其精确切割释放。释放的目标单链DNA与互补寡核苷酸退火后，成功自组装形成预期的三角形纳米结构，原子力显微镜(AFM)成像和凝胶电泳迁移率变化证实了其成功构建。
3.2. 脂质体的制备及单链DNA纳米结构辅助的脂质体分选
研究制备了由特定磷脂配方组成的脂质体，其平均粒径约为144.7纳米。通过将胆固醇修饰的mTriangle-AP613-1与脂质体孵育，实现了DNA纳米结构对脂质体的包被。随后，利用等密度超速离心技术，成功将包被后的脂质体按不同尺寸分离开来，透射电镜(TEM)确认了不同组分中脂质体的尺寸均一性。
3.3. mTriangle-AP613-1的亲和力分析
通过表面等离子体共振(SPR)技术测定了结合亲和力。结果表明，游离的AP613-1适配体与GPC3蛋白的解离常数(KD)约为271 ± 5.76 nM。而当AP613-1被整合进三角形DNA纳米结构后，其形成的mTriangle-AP613-1与GPC3的亲和力显著提升，KD值达到15.2 ± 0.21 nM，说明DNA纳米结构增强了适配体的结合能力。作为对照，不包含适配体的空载纳米结构(mTriangle)与GPC3无明显相互作用。
3.4. mTriangle-AP613-1-脂质体的体外靶向分析
通过蛋白质印迹(Western blot)、流式细胞术和细胞免疫荧光技术，确认了所用HepG2和Huh-7细胞为GPC3高表达细胞株，而MGC-803细胞为低表达细胞株。研究显示，Cy5.5标记的mTriangle-AP613-1-脂质体能够特异性结合GPC3高表达的HepG2和Huh-7细胞，荧光信号显著强于GPC3低表达的MGC-803细胞。而空载的mTriangle-脂质体在所有细胞系中均未显示明显信号。竞争结合实验进一步证实了其靶向特异性。
3.5. 阿霉素(DOX)的包载
采用硫酸铵梯度法，成功将DOX包载于脂质体内部，包封率超过90%。稳定性实验表明，包载DOX的脂质体在不同pH值的缓冲液中能保持稳定，药物不易泄漏。
3.6. 体外细胞毒性分析
细胞毒性试验表明，空白脂质体和mTriangle-AP613-1纳米结构在实验浓度下对细胞无明显毒性。然而，包载DOX的脂质体对三种细胞系均表现出显著的杀伤作用。更重要的是，在GPC3高表达的Huh-7细胞中，靶向性的mTriangle-AP613-1-脂质体(DOX)在相同DOX浓度下，比非靶向的脂质体(DOX)和游离DOX表现出更强的细胞杀伤效果。
3.7. 体内安全性评估及抗肿瘤疗效
在Huh-7细胞荷瘤裸鼠模型中，评估了该递送系统的体内疗效。与生理盐水组和非靶向的mTriangle-脂质体(DOX)组相比，靶向的mTriangle-AP613-1-脂质体(DOX)治疗能更显著地抑制肿瘤生长，肿瘤体积和重量均明显减小。核酸酶降解实验显示，mTriangle-AP613-1比游离AP613-1具有更强的抗核酸酶降解能力。肿瘤组织成像显示，注射后24小时，mTriangle-AP613-1-脂质体(DOX)能特异性富集在肿瘤组织内，而对照组则无此现象。安全性评估显示，该治疗未对心、肾功能造成显著影响，虽对肝功能指标（ALT、AST）有轻微影响，但独立的安全性实验表明，单独注射mTriangle-AP613-1-脂质体对健康小鼠的肝功能无明显影响，提示治疗相关的肝指标变化可能与DOX代谢有关。
研究结论与意义
本研究成功构建并验证了一种新型的靶向纳米药物递送系统——mTriangle-AP613-1-liposomes (DOX)。该系统通过创新的DNA折纸技术，将GPC3特异性适配体AP613-1整合进结构稳定的三角形单链DNA纳米骨架中，不仅大幅提升了适配体在体内的生物稳定性和对靶点的亲和力，还通过噬菌粒系统实现了大规模、低成本的生产。将此功能化纳米结构装载到包载化疗药物DOX的脂质体上，最终形成了一个“三位一体”的智能递送平台。
该平台在体外能精准识别并内吞进入GPC3阳性的肝癌细胞，在体内能有效富集于肿瘤部位，并显著抑制肿瘤生长，同时展现出良好的生物安全性。这项工作巧妙地解决了小分子适配体体内应用不稳定的瓶颈，并融合了DNA纳米技术与脂质体递送的优势，为肝癌的精准靶向治疗提供了一种高效、安全的新策略。更重要的是，这种基于适配体-核酸纳米结构的构建思路具有高度的可编程性和模块化特性，为针对其他特定靶点的纳米药物开发提供了可借鉴的通用平台，推动了精准肿瘤学领域的发展。
