《Materials Today Bio》：Dual targeted gene delivery strategy mediated by GalNAc-modified lipid nanoparticles enhances liver regeneration through specific knockdown of MKK4
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急性/慢性肝病常与肝再生障碍相关，但目前尚无获批药物可特异性促进肝再生。本文中，研究人员设计了一种双重靶向基因治疗系统GalNAc-LNP-siMKK4，旨在通过精确下调促凋亡蛋白MKK4的表达，从而促进肝细胞增殖和肝功能恢复，为解决ACLF的治疗难题提供了新的潜在策略。
肝脏拥有非凡的再生能力，是维持生命的关键。然而，急性或慢性肝损伤（如酒精肝、药物性肝损伤、肝硬化、肝纤维化乃至肝癌）会削弱这种能力，导致肝功能衰竭。尤其对于患有基础慢性肝病的患者，肝切除手术后极易诱发慢加急性肝衰竭（ACLF），其死亡率高达25%-30%。目前，肝移植是ACLF的根本疗法，但因供体短缺、手术创伤大、免疫抑制剂长期使用带来的感染风险等问题难以广泛应用。人工肝支持系统虽可暂时替代肝功能，但无法修复受损的肝再生能力。临床上使用的保肝药物多通过抗炎、解毒、利胆等作用减轻病理损伤，但并不能直接促进肝细胞增殖。因此，迫切需要开发能够有效促进肝再生的新型治疗策略。
丝裂原活化蛋白激酶激酶4（MKK4）是应激激活蛋白激酶（SAPK）/丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号网络中的关键蛋白。近年研究证实，抑制MKK4可促进肝细胞增殖，但其在体内广泛表达，非特异性抑制存在脱靶风险。此外，小分子MKK4抑制剂与MKK7因结合口袋相似，也存在脱靶结合MKK7的困扰。相比之下，小干扰RNA（siRNA）能够实现对特定基因的精确沉默。但能否将治疗性siRNA高效、精准地递送到目标细胞（肝细胞）是其发挥疗效的关键。
为了解决上述难题，来自第四军医大学的研究团队在《Materials Today Bio》期刊上发表了一项创新性研究。他们设计了一种名为GalNAc-LNP-siMKK4的双重靶向基因治疗系统，旨在通过特异性敲低肝细胞内的MKK4，安全有效地促进肝再生，为治疗ACLF提供了新思路。
本研究运用的主要关键技术方法包括：1）利用反相蒸发法制备装载siMKK4的GalNAc修饰脂质纳米颗粒（LNP）；2）通过凝胶电泳、动态光散射、透射电镜等技术对纳米粒的包封率、粒径、稳定性等进行表征；3）在体外使用AML-12肝细胞模型，通过CCK-8、克隆形成、免疫荧光、Western Blot等实验评估纳米粒的靶向性、细胞毒性、促增殖效果及分子机制；4）构建CCl4诱导联合部分肝切除的小鼠ACLF体内模型，通过Micro-CT、组织病理学、免疫组化、血液生化分析和生存率研究，系统评估GalNAc-LNP-siMKK4的治疗效果、靶向分布及安全性。
3.1. GalNAc-LNP-siMKK4的制备与表征
研究人员首先筛选出最有效的siMKK4序列。通过优化N/P比（氮/磷比），确定了当N/P比为6时，siMKK4能被LNPs完全装载，并能有效抵抗核糖核酸酶（RNase）的降解。接着，他们筛选了GalNAc-PEG2000-DSPE靶向基团的最佳摩尔比例（5%），该比例在保证纳米粒良好细胞摄取的同时，实现了最高的MKK4基因沉默效果。表征结果显示，GalNAc-LNP-siMKK4粒径均一（约176 nm），电位适中（+20.4 mV），具有良好的稳定性、血液相容性和低细胞毒性。纳米粒能持续释放siRNA，包封率达96.7%。
3.2. GalNAc-LNP-siMKK4的体外和体内肝细胞靶向能力
竞争性细胞摄取实验表明，GalNAc的预孵育可显著抑制GalNAc-LNP-siNC-FAM被AML-12细胞的摄取，证明其摄取是通过GalNAc与细胞表面去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）的特异性结合介导的。体内器官分布实验显示，GalNAc-LNP-siNC-FAM在尾静脉注射后6小时在肝脏中富集最多，且保留时间更长。进一步的肝脏组织共定位分析证实，与非靶向的LNP相比，GalNAc-LNP-siNC-FAM与肝细胞标志物HNF-4α的共定位显著增强，而与库普弗细胞标志物CD68、肝窦内皮细胞标志物CD31的共定位减少，证明GalNAc修饰有效增强了纳米粒对肝实质细胞的主动靶向能力。
3.3. GalNAc-LNP-siMKK4在体外促进细胞增殖的作用
在CCl4损伤的AML-12细胞模型中，GalNAc-LNP-siMKK4处理显著增加了细胞克隆形成面积和细胞活力（MTT法），并大幅提高了细胞增殖标志物Ki67的表达。这些结果证明，GalNAc-LNP-siMKK4能有效促进受损肝细胞的增殖。
3.4. GalNAc-LNP-siMKK4在体外促进细胞增殖的机制
通过免疫荧光和Western Blot分析分子机制发现，GalNAc-LNP-siMKK4处理后，肝细胞内MKK4及其磷酸化形式（p-MKK4）的表达下调，导致其下游促凋亡信号分子p-p38的激活减弱。同时，作为补偿，同属于ASK1下游的激酶MKK7的磷酸化（p-MKK7）增强，进而激活了促增殖的JNK1（p-JNK1）及其下游转录因子ELK1（p-ELK1）和ATF2（p-ATF2）。这表明GalNAc-LNP-siMKK4通过下调MKK4-p38凋亡通路，同时上调MKK7-JNK增殖通路，从而打破平衡，将细胞状态推向增殖。
3.5. GalNAc-LNP-siMKK4对小鼠慢加急性肝衰竭的治疗效果
在CCl4诱导的慢性肝损伤联合部分肝切除建立的ACLF小鼠模型中，GalNAc-LNP-siMKK4显示出卓越的治疗效果。Micro-CT成像显示，该治疗能显著促进术后肝脏体积的再生。生存分析表明，GalNAc-LNP-siMKK4治疗将小鼠生存率从模型组的62.5%提高至100%。组织学检查（H&E染色）显示其能保护肝脏微观结构，减少坏死区域；Ki67染色阳性细胞数显著增加，而TUNEL染色显示的凋亡细胞数大幅减少。血液生化指标（ALT、AST）的恢复以及白蛋白（ALB）合成功能的提升、血氨（BA）水平的正常化，均证实了其促进肝功能恢复的效果。
3.6. GalNAc-LNP-siMKK4治疗ACLF的机制
在体实验的机制研究与体外结果一致。GalNAc-LNP-siMKK4治疗组小鼠肝脏组织中，MKK4/p-MKK4/p-p38信号减弱，而p-MKK7/p-JNK1/p-ELK1/p-ATF2信号增强。使用JNK1抑制剂（SP600125）或p38激动剂（dehydrocorydaline chloride）可逆转GalNAc-LNP-siMKK4的促增殖作用，证实其疗效依赖于JNK1的激活和p38的抑制。此外，治疗未对心、脾、肺、肾等主要器官造成显著病理损伤，也未影响肾脏功能指标（UREA, BUN, CR），初步显示了其良好的安全性。
结论与讨论
本项研究成功构建了一种新型双重靶向基因治疗系统GalNAc-LNP-siMKK4。该系统巧妙地结合了脂质纳米颗粒（LNP）固有的肝脏趋向性和GalNAc配体对肝细胞表面ASGPR受体的主动靶向能力，实现了从器官到细胞水平的精准递送。研究表明，该系统能高效、特异地将靶向MKK4的siRNA递送至肝细胞，通过下调MKK4表达，打破MKK4-p38（促凋亡）与MKK7-JNK（促增殖）通路之间的平衡，从而有效促进肝细胞增殖、抑制凋亡，在ACLF小鼠模型中显著促进了肝再生、恢复了肝功能并提高了生存率。
这项工作的意义在于：首先，首次将siMKK4应用于促进肝再生，利用RNA干扰（RNAi）技术的精确性，避免了小分子抑制剂可能存在的脱靶效应（尤其是对MKK7的影响）。其次，创新的双重靶向设计（被动靶向+主动靶向）提高了基因递送的效率和特异性，有望增强疗效并减少对非靶细胞的副作用。最后，该研究为目前缺乏有效促再生药物的ACLF及其他肝再生障碍相关疾病，提供了一种具有转化潜力的基因治疗新策略。尽管仍需更全面的长期安全性和有效性评估，但GalNAc-LNP-siMKK4系统代表了一种针对肝脏疾病进行精准、高效基因治疗的有力探索。
