一种具有临床意义的逆行导管内注射（RIDI）技术，用于在胰腺中通过脂质纳米颗粒介导的碱基编辑

《Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine》：A clinically relevant retrograde intraductal injection (RIDI) for lipid nanoparticles-mediated base editing in the pancreas

【字体：大中小】 时间：2026年03月26日 来源：Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine 4.2

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　　基因治疗与编辑在胰腺疾病中的应用潜力及递送挑战

美国俄勒冈州立大学罗伯逊生命科学学院药学院药学科学系，波特兰，OR

摘要

基因疗法为许多胰腺疾病（包括糖尿病和遗传性胰腺炎）提供了潜在的治愈策略。然而，其临床应用受到了有效递送平台缺乏的阻碍。脂质纳米颗粒（LNPs）已被确立为核酸的非病毒性递送系统；然而，全身给药后，它们的靶向性仅限于肝脏。在这项研究中，我们评估了逆行导管注射（RIDI）这种临床相关且常规进行的内镜技术，作为LNPs直接递送到胰腺组织的途径。将Cre mRNA负载的LNPs通过RIDI注射后，约47%的腺泡细胞发生了转染，从而实现了显著的重组。将这种方法扩展到基因编辑领域后，我们在小鼠模型中观察到约20-30%的基因编辑率和5%的碱基编辑率。总体而言，这些发现表明RIDI是一种可行的胰腺靶向LNPs递送策略，突显了其在胰腺疾病中实现基因疗法和基因编辑的潜力。

引言

基因疗法和基因编辑为许多胰腺疾病（包括糖尿病和遗传性胰腺炎）提供了潜在的治愈策略。¹尽管已有许多治疗胰腺疾病的 small molecule 药物，但仍存在局限性。例如，用于胰腺癌的化疗药物（如Nab-paclitaxel/gemcitabine和FOLFIRINOX）虽然提高了总体生存率，但在过去30年的持续努力下仍未能使患者的生存期延长超过5年。²像miRNA、siRNA、mRNA或基因编辑器这样的核酸药物，能够提供比现有small molecule药物更有效的治疗方法。³然而，这些核酸药物在体内递送方面面临挑战，因为它们分子量大、带有负电荷、容易在体内条件下被核酸酶降解且不稳定。因此，开发可靠的递送系统对于这些基因药物至关重要。过去几十年里，人们做出了很多努力，脂质纳米颗粒（LNPs）已成为用于递送治疗性核酸的最有前景的非病毒性纳米载体之一，适用于基因沉默、蛋白质替代、免疫疗法和基因编辑等多种应用。⁴LNPs的可靠性和递送能力从基于siRNA的LNPs产品（Onpattro?、Givlaari?、Leqvio?）、基于mRNA的LNPs产品（Comirnaty?、Spikevax?）以及基于基因编辑器的LNPs产品（NTLA-2001和NTLA-2002）的临床开发和FDA批准中得到了验证。^{5, 6, 7, 8}与LNPs相关的一个主要挑战是高效的肝外递送。全身给药后，LNPs会被载脂蛋白E（ApoE）内源性包被，从而引导它们向表达低密度载脂蛋白受体（LDLR）的肝细胞输送。⁹随着基因递送技术的发展，研究人员最近能够根据电荷调节LNPs的靶向性，使其能够靶向肺部¹⁰和脾脏¹⁰。然而，开发能够靶向胰腺的LNPs仍然是一个重大挑战。由于给药途径是调节LNPs肝外递送的关键因素，人们尝试通过腹腔途径来实现这一目标。例如，Melamed等人报告了通过巨噬细胞辅助的基因转移将LNPs成功递送到胰腺¹²。然而，腹腔注射目前仅限于啮齿动物的临床前研究。在临床环境中，腹腔注射存在多个限制，包括人体内的快速腹腔清除、由于腹腔液循环导致的稀释或降解、神经支配引起的疼痛和不适以及难以估计适当剂量¹³。为了高效地靶向胰腺，确定一条具有最小脱靶效应的理想递送途径至关重要。除了腹腔注射外，还探索了多种基因递送途径，包括直接胰腺注射^{14, 15}、全身递送^{16, 17}（结合肝脏循环阻断）、腹腔/肝动脉递送¹⁸以及逆行导管递送^{19, 20}等。最近，Quirin等人确定了三种不同AAV血清型（AAV6、AAV8和AAV9）逆行导管注射的安全性和有效性。研究发现，1 × 10¹¹ vg scAAV6的导管内注射能够以超过50%、48%和80%的效率分别转染腺泡细胞、导管细胞和胰岛细胞；而5 × 10¹¹ vg的注射效率更高²¹。总体而言，这项研究证明了通过逆行导管注射使用AAV的安全性。在这里，我们报道了利用逆行导管注射（RIDI）将LNPs介导的mRNA递送到胰腺的方法。为了确定RIDI的可重复性和精确性，我们首先通过RIDI注射了一种绿色染料或紫外光激发的染料。结果发现，即使注射量很小，染料也能在胰腺中均匀分布。LNPs由四种成分组成：可电离的阳离子脂质、膜脂质、固醇和PEG化脂质，这四种成分在水环境中能够自组装²²。我们制备了三种不同的LNPs，分别含有胆固醇、谷氨酸-胆固醇或甘露醇-胆固醇，分别称为Chol LNPs、G-Chol LNPs和Mn-Chol LNPs。为了评估体内效率，我们将这三种LNPs用于封装Cre-mRNA，并通过RIDI注射到mTmG报告基因小鼠体内（见图3a），随后通过共聚焦成像和流式细胞术分析胰腺中的Cre重组情况。进一步评估LNPs的基因编辑潜力时，我们用Cas9 mRNA/Ai9sgRNA制备了这三种LNPs，并将其注射到Ai9小鼠体内（见图4a），然后通过共聚焦显微镜和下一代测序技术评估基因编辑效果。结果显示胰腺中有显著的基因编辑现象。为了进一步拓展RIDI的应用，我们将带有碱基编辑器（ABE）的LNPs通过RIDI注射到LumA小鼠体内（见图5a），并在注射后2周、3周和5周观察到了碱基编辑效果。总体而言，这项研究验证了RIDI在胰腺疾病中用于LNPs介导的基因疗法和基因编辑的潜力。

材料

D-Lin-MC3-DMA、LP01、DSPC和DMG-PEG2k从Avanti Polar Lipids购买。谷氨酸、甘露醇、胆固醇、DMEM培养基和Quant-iT RiboGreen检测试剂盒从Thermo Scientific购买。G-Chol和Mn-Chol是在实验室合成的。Cre mRNA和Cas9 mRNA从Helix Bioscience购买。Ai9sgRNA由Integrated DNA Technologies（IDT）合成。

细胞培养

细胞在添加了10%热灭活胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，目录编号#11965175）中培养

胆固醇衍生物的合成与表征

G-Chol和Mn-Chol的合成与表征见补充材料。

脂质纳米颗粒的制备与表征

对于初步筛选，使用微流控混合方法制备了含有FLuc mRNA的Chol LNPs、G-Chol LNPs和Mn-Chol LNPs。Chol LNPs、G-Chol LNPs和Mn-Chol LNPs的粒径分别为约56 nm、约138 nm和约79 nm，多分散指数<0.3（见图1c）。Chol LNPs、G-Chol LNPs和Mn-Chol LNPs的包封效率分别为98.5%、91%和98%（见图1）

讨论

历史上，LNPs的肝外递送依赖于以下三种方法之一：(i) 全身给药并采用肝脏脱靶策略；(ii) 腹腔注射以利用腹腔淋巴系统；(iii) 直接进行实质内注射。每种方法都存在显著的转化障碍。静脉注射会受到ApoE介导的肝脏捕获；腹腔注射在人体中的效果不佳，因为腹腔清除速度快且剂量难以控制；而直接注射...

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Deepak Sahel：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、验证、软件开发、方法学设计、实验设计、数据分析、概念构思。 Amita Tiyaboonchai：撰写——审阅与编辑、实验设计、数据分析。 Leslie Wakefield：可视化、数据分析。 Jonas Renner：数据分析。 Antony Jozic：数据分析。 Craig Dorrell：方法学设计、数据分析。