腺苷A2B受体拮抗剂在铜锌矾诱导的脱髓鞘模型中的保护作用

《Neuropharmacology》：Protective effects of adenosine A2B receptor antagonism in a cuprizone-induced demyelination model

脱髓鞘疾病中A2B受体调控机制研究：通过杯rizone诱导的小鼠模型，证实选择性拮抗剂PSB 603可减轻胶质细胞反应并促进髓鞘再生，而激动剂BAY60-6583虽改善运动障碍但对髓鞘修复效果有限。

　　

作者名单：Federica Cherchi、Martina Venturini、Lucia Frulloni、Federica Panozzi、Giada Magni、Clara Santalmasi、Camilla Maestrelli、Maria Grazia Giovannini、Elisabetta Coppi、Daniele Lana、Anna Maria Pugliese

佛罗伦萨大学神经科学、心理学、药物研究与儿童健康系（NEUROFARBA），意大利佛罗伦萨

摘要

脱髓鞘疾病的特点是中枢神经系统（CNS）中髓鞘的逐渐丧失。通过促进少突胶质细胞前体细胞分化为成熟的少突胶质细胞，可以实现对髓鞘的保护，而少突胶质细胞是大脑中唯一的髓鞘形成细胞。少突胶质细胞的成熟过程受到神经调节剂腺苷的调控，腺苷通过其特异性受体A₁、A_2A、A_2B、A₃发挥作用，这些受体均表达在神经元和胶质细胞上。本研究在雄性C57BL/6小鼠中，使用杯克罗酮（cuprizone）诱导的脱髓鞘模型，通过给予选择性A_2B受体激动剂BAY60-6583或拮抗剂PSB 603，在为期5周的杯克罗酮饮食的最后2周内探究了A_2B受体的作用。研究内容包括体重评估、行为测试和免疫荧光分析。结果显示，喂食杯克罗酮的小鼠体重增长显著减少，运动功能受损，自发活动能力下降。这些现象与髓鞘水平下降、胼胝体中部、纹状体和运动皮层的反应性星形胶质细胞和小胶质细胞活化有关。PSB 603能够防止杯克罗酮对胶质细胞的损害，而两种化合物均有助于改善运动缺陷。因此，抑制A_2B受体可能是一种有效的策略，可用于减轻脱髓鞘条件下中枢神经系统的髓鞘损伤和胶质细胞活化。

引言

中枢神经系统（CNS）的脱髓鞘疾病（如多发性硬化症）表现为髓鞘鞘的丢失，导致神经元传导功能障碍和神经学缺陷。这些疾病涉及复杂的病理机制，包括氧化应激、线粒体功能障碍和慢性炎症，其中胶质细胞起着核心作用。杯克罗酮（CPZ）模型是一种公认的非免疫介导的脱髓鞘模型，其特征是选择性少突胶质细胞丢失、反应性星形胶质细胞活化以及毒素撤除后的再髓鞘形成（Vega-Riquer等人，2019年）。 在参与中枢神经系统损伤的神经调节系统中，腺苷信号通路通过其四种G蛋白偶联受体（A₁、A_2A、A_2B、A₃）发挥关键作用，调节神经元兴奋性和突触传递，并调控神经炎症和胶质细胞反应性（Fredholm等人，2011年）。此外，在缺氧或缺血条件下，腺苷水平会升高，这是上述病理过程进展的关键因素（Pedata等人，2016年）。在脱髓鞘疾病中，嘌呤能信号通路的作用已被充分证实（参见Coppi等人，2021年）。然而，目前仅能推测这些条件下腺苷细胞外浓度的增加。 在所有腺苷受体中，A_2B受体（A2BR）因其对腺苷的低亲和力以及在细胞外腺苷水平升高时的上调作用而备受关注（Coppi等人，2020年；Wei等人，2013年）。已知A_2B受体表达在星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞中，它们调节炎症介质的释放并影响胶质细胞反应性。具体而言，A_2B受体的激活会抑制少突胶质细胞前体细胞（OPC）的分化和髓鞘基因的表达，部分机制涉及抑制K⁺电流和调节鞘氨醇-1-磷酸信号通路（Cherchi等人，2021a；Coppi等人，2020年）。研究表明，在体外沉默A_2B受体可促进OPC的成熟，而在氧糖剥夺模型中，选择性药物阻断具有神经保护作用（Coppi等人，2020年；Fusco等人，2018年）。 Wei及其同事（Wei等人，2013年）在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的研究中发现，使用选择性拮抗剂CVT-6883或MRS1754进行药物阻断可以缓解临床症状并保护中枢神经系统免受免疫介导的损伤。相应地，A_2B受体敲除（A2BR^-/^-）小鼠的EAE表型明显较轻（Wei等人，2013年）。 尽管有这些发现，A_2B受体在毒素诱导的脱髓鞘中的作用仍需进一步研究。为此，我们在C57BL/6小鼠中使用了杯克罗酮模型，这是一种通过少突胶质细胞毒性诱导可逆性脱髓鞘的公认非自身免疫模型。该模型可同时评估脱髓鞘和再髓鞘阶段以及潜在的治疗干预措施，且不受周围免疫细胞浸润的干扰。在本研究中，我们在给予杯克罗酮的同时测试了A_2B受体激动剂（BAY60-6583）和选择性拮抗剂（PSB 603）的作用。本研究旨在阐明A_2B受体信号通路在脱髓鞘过程中的作用，并评估其药物干预是否能在特定情况下促进髓鞘保护和/或胶质细胞调节。

动物实验

所有动物实验均按照意大利动物护理指南DL 116/92、欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC）进行，并得到佛罗伦萨大学动物护理与实验使用委员会的批准。雄性C57BL/6小鼠购自意大利Charles River Laboratories。批准的动物实验方案编号为936/2021-PR。实验前，小鼠被允许适应新环境约4天。

A2B受体配体对杯克罗酮诱导的体重增长和运动活动的影响

实验开始时（第0天），雄性C57BL/6小鼠的体重为23-25克。在为期3周的杯克罗酮饮食期间，与对照组相比，这些小鼠的体重增长显著减少（图3A）。统计分析显示，时间（F(6,133)=9.487, P<0.0001）和处理方式（F(1,133)=19.02, P<0.0001）对体重变化均有显著影响，但两者之间无交互作用（F(6,133)=1.425, P=0.2096）。具体而言，两组小鼠均表现出体重增长的趋势。

讨论

本研究评估了A_2B受体调节在杯克罗酮诱导的小鼠脱髓鞘过程中的潜在保护作用，重点关注与脱髓鞘损伤相关的胶质细胞变化，通过使用PSB 603或BAY60-6583进行实验。数据表明，A_2B受体的选择性药物阻断具有保护作用，可促进大脑中主要脱髓鞘部位（CCM）以及CTX和ST区域的髓鞘恢复。

作者贡献声明

Maria Grazia Giovannini：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、监督、资金申请。 Camilla Maestrelli：方法学设计、数据分析。 Clara Santalmasi：方法学设计、数据分析。 Giada Magni：方法学设计、数据分析。 Federica Cherchi：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、监督、方法学设计、实验设计、数据管理、概念构思。 Anna Maria Pugliese：撰写、审稿与编辑、监督、资源协调、资金支持。

未引用参考文献

Ye等人，2013年。

利益冲突声明 作者声明与本研究无任何利益冲突。

关于手稿制作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明 在准备本手稿时，作者使用了Notebooklm工具来创建图形摘要的背景图像。使用该工具后，作者对内容进行了必要的审阅和编辑，并对出版物的内容负全责。

资助信息 本研究由以下机构资助： - 佛罗伦萨大学（Università degli Studi di Firenze），资助编号：RICATEN: AMP, MGG, EC, DL。 - 欧盟下一代计划（Next Generation European Union），在国家恢复与韧性计划（National Recovery and Resilience Plan）框架下，M4C2投资1.5（THE - Tuscany Health Ecosystem），项目编号CUP B83C22003920001：AMP。 - 国家恢复与韧性计划M4C2投资1.4（CN00000041 CN3 “基于RNA技术的国家基因治疗和药物中心”项目，项目编号CUP:13C22001010001：AMP, MGG。 - FISM – 意大利多发性硬化症基金会（FISM – Fondazione Italiana Sclerosi）。

利益冲突声明 作者声明不存在可能影响本论文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢 共聚焦显微镜检测工作在意大利佛罗伦萨的Cnr-Istituto di Fisica Applicata “Nello Carrara”进行。