《Cell Proliferation》：Establishment of Human Formative Pluripotent Stem Cell-Like Cells Exhibiting Amniotic Differentiation Potentials
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本研究针对人类胚胎植入后早期发育阶段样本稀缺、伦理受限，导致对多形性重编程的关键时期认知不足的难题，研究人员利用三维Matrigel培养系统，成功建立了具有羊膜分化潜能的人类可形成性多能干细胞样细胞(hfPSC-LCs)。该模型表现出多能性标记，能高效分化为三个胚层、原始生殖细胞样细胞，特别是可生成转录组和形态上与真实羊膜相似的人羊膜样前体细胞，为研究人类可形成性多能性及其转换，以及早期胚胎发生特别是羊膜形成过程，提供了强大的三维体外模型，填补了相关研究空白。
生命是如何从一个简单的受精卵，逐步发育成一个包含所有复杂组织和器官的完整个体的？这个问题一直是发育生物学领域的核心谜题。在哺乳动物，特别是人类的早期发育过程中，胚胎植入子宫后不久，会经历一场至关重要的形态发生重塑。然而，由于人类胚胎样本极为稀缺以及严格的伦理限制，我们对这个关键阶段的理解犹如隔雾看花，存在巨大的知识缺口。多能干细胞因其具有分化为所有体细胞谱系和生殖细胞的能力，成为研究胚胎着床后上胚层的重要体外模型。传统上，人类多能干细胞被分为类似于小鼠植入前胚胎的“初始”状态和类似于植入后、原肠胚形成前“启动”状态。近年来，科学家们发现了一个介于两者之间的、被称为“可形成性”的中间多能性状态，它像是连接发育连续谱的一座桥梁，但关于人类可形成性多能性的研究仍然非常有限。
为了破解人类早期胚胎发育的“黑箱”，特别是模拟着床后上胚层向羊膜等胚外组织分化的过程，研究人员在先前小鼠可形成性多能干细胞研究的基础上，开展了一项创新性工作。他们想知道，模拟体内微环境的培养系统能否帮助我们在体外建立并维持人类的多能性中间状态？这种状态下的细胞是否具有独特的发育潜能，特别是模拟人类特有的早期发育事件，比如羊膜的形成？为此，研究人员在《Cell Proliferation》上发表论文，报道了他们成功建立了一种新型的人类可形成性多能干细胞样细胞，为研究人类可形成性多能性和早期胚胎发生提供了新工具。
为开展这项研究，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先，他们建立了基于三维Matrigel的培养系统，从初始人胚胎干细胞、常规人胚胎干细胞、人诱导多能干细胞以及人类囊胚中，衍生出目标细胞。其次，他们进行了系统的细胞功能验证，包括向心肌细胞、神经前体细胞、定形内胚层、原始生殖细胞样细胞以及人羊膜样前体细胞的分化诱导实验。再者，研究采用了多种组学分析技术，如RNA测序、单细胞RNA测序、染色质可及性测序和全基因组甲基化测序，从多个维度深入解析了所建立细胞的分子特征。此外，免疫荧光染色、流式细胞术、核型分析等也是本研究用于表征细胞状态、纯度和稳定性的重要手段。本研究中的人类囊胚样本来源于接受体外受精治疗的夫妇所捐赠的剩余冷冻胚胎。
3.1 人类可形成性多能干细胞样细胞的建立
研究人员优化了培养条件，使用Essential 8 (E8)基础培养基并添加Wnt通路抑制剂IWP2，在三维Matrigel中成功建立了可长期传代、自我更新的人类可形成性多能干细胞样细胞，并将其命名为hfPSC-LCs。这些细胞可以从小鼠初始状态的人胚胎干细胞、常规人胚胎干细胞、人诱导多能干细胞甚至人类囊胚中成功建立。hfPSC-LCs形成的克隆呈玫瑰花结样结构，具有顶腔，表达经典多能性标记（OCT4/POU5F1、SOX2、NANOG）和可形成性标记OTX2，并保有正常的核型。
3.2 hfPSC-LCs拥有独特的转录组和表观基因组特征
转录组分析表明，hfPSC-LCs的基因表达谱既不同于初始状态，也不同于启动状态的人胚胎干细胞，并且与已报道的其他人类可形成性多能干细胞模型（如hXPSCs和hFS-like细胞）也存在差异。主成分分析显示，hfPSC-LCs在转录水平上更接近体内约受精后10天（E10.0）的上胚层细胞。单细胞转录组测序提示hfPSC-LCs的细胞群体均一性优于传统人胚胎干细胞。表观遗传分析发现，与原始生殖细胞和羊膜相关基因在hfPSC-LCs中具有更开放的染色质可及性，这预示了其向这两个谱系分化的潜力。DNA甲基化水平分析显示，hfPSC-LCs的全局甲基化水平与常规和启动状态的人胚胎干细胞相似。
3.3 从hfPSC-LCs诱导体细胞和生殖细胞谱系
功能实验证实，hfPSC-LCs具有分化为三个胚层细胞的能力。它们可以被诱导成具有节律性搏动的心肌细胞、表达SOX17和FOXA2的定形内胚层细胞，以及能形成神经玫瑰花结并进一步分化为神经元的神经前体细胞。尤为重要的是，hfPSC-LCs无需经过中间中胚层样细胞阶段，就能以单细胞聚集体或完整克隆的形式，直接高效地（效率约50%）产生共表达SOX17和TFAP2C的原始生殖细胞样细胞。
3.4 从hfPSC-LCs建立人羊膜样前体细胞
研究的一个突出亮点是，hfPSC-LCs在特定培养条件下（抑制MAPK和ALK信号通路）可以分化为囊泡状结构。这些结构表达羊膜上皮细胞的关键标记，如E-Cadherin、KRT18、TFAP2A、TFAP2C和GATA2/3，而不再表达多能性标记OCT4。研究人员将这些可有限传代（最多至第5代）的细胞称为人羊膜样前体细胞。转录组分析表明，hALPCs与从足月婴儿羊膜分离的羊膜上皮干细胞高度相似，表达早期和晚期羊膜上皮的标记基因，但几乎不表达滋养层细胞标记，提示其较好地模拟了真实的羊膜细胞。
3.5 三维Matrigel赋予hfPSC-LCs可形成性特征
研究人员探讨了三维培养环境的关键作用。他们发现，与在二维基质胶平面培养或悬浮培养的人胚胎干细胞相比，hfPSC-LCs高表达与细胞外基质组装和胆固醇生物合成相关的基因。当将已建立的小鼠可形成性多能干细胞从三维Matrigel环境转移到二维平面培养时，其可形成性标记基因表达下调，上皮-间质转化相关基因表达上调，并且向神经前体细胞、心肌细胞和原始生殖细胞样细胞分化的能力严重受损。这证明三维Matrigel提供的微环境对于建立和维持可形成性多能性至关重要。
4 讨论
本研究的结论在于，研究人员成功开发了一个仿生的三维培养系统，能够稳健地建立自我更新的人类可形成性多能干细胞样细胞。hfPSC-LCs代表了一个新的、转录上类似于人着床后上胚体的可形成性多能状态，具有更高的细胞群体均一性。这些细胞展现出强大的多向分化潜能，不仅能高效产生三个胚层的体细胞和原始生殖细胞，还能特异地分化为与真实羊膜高度相似的人羊膜样前体细胞，而几乎不产生滋养层细胞污染。这项工作的重要意义在于，hfPSC-LCs及其分化系统为研究人类早期胚胎发育，特别是多能性状态的动态转换、原始生殖细胞指定以及羊膜发生等关键生物学事件，提供了一个独特且强大的三维体外模型。研究还强调了三维细胞外基质微环境在塑造和维持可形成性多能细胞状态中的不可或缺的作用。该模型有望在未来用于模拟人类早期胚胎发育、研究相关发育性疾病，并为再生医学和疾病建模提供新的细胞来源。
