《Pathology - Research and Practice》：Non-Viral and mRNA-Based Strategies for Next-Generation CAR-T Cell Therapy.
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本文探讨mRNA工程与非病毒递送系统（如脂质纳米颗粒、电穿孔和外泌体）的整合，以支持体外和体内CAR-T细胞疗法的生成，并分析表达持久性、递送精准性、制造可扩展性和监管等方面的临床转化障碍，强调计算方法在优化中的应用，指出非病毒和mRNA策略是传统病毒制造的重要补充。
王太平|金峰|邢文正|于书娟
山东第一医科大学口腔医学院及山东省医学科学院，济南，250031，中国
摘要
嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法已经彻底改变了血液系统恶性肿瘤的治疗格局，但其更广泛的应用仍受到基于病毒载体的工程技术的复杂性、成本、生产时间和相关整合风险的限制。随着CAR-T策略扩展到实体肿瘤、自身免疫疾病以及体内CAR-T细胞的生成，这些限制变得越来越重要，而mRNA治疗和非病毒递送技术也在不断进步。然而，非病毒平台和mRNA工程往往被单独讨论，缺乏一个统一的转化视角。在这篇综述中，我们探讨了如何将mRNA工程与非病毒递送系统（包括脂质纳米颗粒、电穿孔和基于外泌体的平台）结合，以支持更安全、更灵活的体外和体内CAR-T细胞的生成。我们还讨论了临床转化的主要障碍，包括表达持久性有限、细胞选择性递送、生产可扩展性以及监管考虑，并强调了计算方法在序列和载体优化方面的新兴作用。这些进展共同支持了对基于非病毒的mRNA-CAR-T工程的及时重新评估，作为开发下一代细胞疗法的实际框架。
引言
嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤治疗中取得了显著临床效益，已成为过继性细胞免疫疗法的主要手段[1]，[2]。自1987年概念提出以来，CAR设计已经从第一代仅包含CD3ζ的受体发展到越来越复杂的结构，以增强T细胞的扩增、持久性和抗肿瘤活性[3]，[4]，[5]，[6]，[7]。除了这种线性进展外，CAR工程还多样化为模块化平台，包括逻辑门控CAR、synNotch电路以及通用或现成的策略[8]，[9]，[10]，[11]，[12]。总体而言，这些进展反映了在提高持久性、特异性和可控性的同时扩大治疗适用范围的迭代努力（表1）。
尽管取得了这些进展，CAR-T疗法的更广泛实施仍受到大多数已批准产品所依赖的生产框架的限制[13]。基于病毒载体的工程具有有限的载药能力[14]、复杂且成本高昂的生产过程[15]、较长的静脉到静脉时间[16]，以及与插入相关的安全问题[17]，[18]，[19]。随着CAR设计变得更加复杂，并且该领域扩展到实体肿瘤、自身免疫疾病和直接的体内免疫细胞工程，这些限制变得越来越重要。
这些生产限制还因新兴CAR-T应用的生物学挑战而加剧。在实体肿瘤中，治疗效果不仅受到抗原异质性的限制，还受到T细胞迁移和浸润受阻、免疫抑制和代谢受限的肿瘤微环境以及渐进的功能性耗竭的影响[20]，[21]。在自身免疫疾病和直接的体内免疫细胞工程中，安全性和时间控制同样重要，特别是因为在非恶性组织中持续的受体活性可能会增加靶向/非肿瘤效应和其他长期免疫毒性的风险[22]。最近关于RNA工程CAR-T细胞在自身免疫疾病中的临床研究，以及早期关于体内CAR-T细胞生成的报道，进一步支持了在这些情况下可控且可能非永久性的工程策略的价值[23]，[24]，[25]。这些病理生理学障碍表明，未来的CAR-T平台必须提供更高的功能复杂性，以及更好的可控性、递送精度和生产适应性。
mRNA工程提供了一种补充策略，以解决其中的一些瓶颈。由于mRNA在细胞质中发挥作用而不需要基因组整合，它能够实现快速且可调节的CAR表达，并可能降低长期基因毒性风险[26]，[27]，[28]。同时，其治疗效用受到一系列机制限制的影响，包括表达持久性有限、易受先天免疫系统检测以及需要高效递送到相关免疫细胞群体中[29]。因此，mRNA在CAR-T疗法中的价值不能脱离用于引入它的递送系统来考虑。
现有的综述通常将非病毒CAR-T生产和mRNA治疗作为单独的主题进行讨论[14]，[30]。相比之下，这篇综述关注这两个领域之间的机制和转化接口。我们探讨了如何将mRNA工程和非病毒递送平台结合起来，以提高安全性、生产灵活性以及体外和体内CAR-T细胞生成的可行性。我们还强调了继续限制临床转化的主要障碍，包括表达动力学、递送精度、可扩展性和监管不确定性，并讨论了计算设计工具在优化mRNA结构和载体系统方面的新兴作用。详细的描述性比较在图表和表格中呈现，使正文能够专注于关键的综合分析，而不是重复性的概述。
病毒载体在CAR-T生产中的局限性
如上所述，病毒载体的限制在CAR-T治疗的制造背景下尤为重要。它们有限的包装能力（通常<9 kb）限制了复杂遗传程序的整合，这些程序对于先进的CAR架构（包括逻辑门控和多基因系统）是必需的[14]。此外，临床级病毒载体的生产必须与个体化的体外T细胞生产相结合，从而导致
用于CAR-T工程的新兴mRNA技术
mRNA疫苗的临床成功重新激发了将这一平台应用于细胞工程的兴趣[30]。在CAR-T应用中，mRNA的主要优势在于能够实现非整合性和时间可控的CAR表达；然而，其转化价值取决于是否可以在不损害T细胞适应性的情况下实现足够的治疗窗口[26]，[27]，[28]。临床研究表明，mRNA工程CAR-T细胞的体内持久性存在差异
用于体外CAR-T工程的非病毒递送平台
基于上述mRNA优化策略，本节探讨了用于将编码CAR的mRNA引入T细胞的非病毒递送系统（图1）。这些平台大致可以分为物理方法（例如，电穿孔、光穿孔和纳米注射）和基于载体的系统（例如，脂质纳米颗粒和外泌体）。它们的比较特征在表2中总结，而下面的文本则重点介绍代表性机制、研究等
讨论与未来方向
现有文献表明，非病毒CAR-T工程不应被视为单一的技术类别，而应视为具有不同转化优势和限制的一系列平台。与早期通常分别讨论非病毒生产、mRNA优化或体内工程的综述相比，这里综合的证据支持一个更加整合的视角。电穿孔仍然是体外mRNA CAR-T最先进的临床策略
结论
总之，非病毒和基于mRNA的策略正成为传统病毒CAR-T生产的重要补充方法，而不是普遍替代方案。它们的主要优势在于提高了安全性、更大的工程灵活性，以及简化或加速生产的潜力，特别是对于需要短暂表达或未来体内实施的应用。在当前的平台中，电穿孔仍然是体外应用最先进的
缩写
AI，人工智能；aLNPs，活化脂质纳米颗粒；CAR，嵌合抗原受体；COMET，复合材料变压器；DBTL，加速设计构建测试学习；FAP，成纤维细胞活化蛋白；HPLC，高效液相色谱；IVT，体外转录；LNPs，脂质纳米颗粒；ML，机器学习；MHC，主要组织相容性复合体；ORF，开放阅读框；PBAE，聚β-氨基酯；PBMCs，外周血单核细胞；saRNA，自扩增文献搜索和选择标准
本手稿是一篇基于结构化文献搜索的叙述性综述。通过使用与“CAR-T”、“嵌合抗原受体T细胞”、“mRNA”、“非病毒递送”、“脂质纳米颗粒”、“电穿孔”、“外泌体”、“体内工程”和“细胞疗法生产”相关的关键词组合，在PubMed、Web of Science和Google Scholar中识别了相关研究。我们优先考虑了经过同行评审的英文原始文章、临床研究和高质量的研究
作者贡献
所有作者都参与了研究的概念设计和构思。数据收集和分析由王太平、金峰和邢文正完成。手稿的第一稿由王太平和金峰撰写。舒书娟负责监督和项目管理。所有作者都阅读并批准了最终稿件。
伦理批准
不适用。
参与同意
不适用。
出版同意
不适用。
数据可用性
本研究中生成和/或分析的数据集可应相应作者的要求提供。
资助
本工作得到了山东省医疗卫生科学技术项目[202408041081]的财政支持。
CRediT作者贡献声明
邢文正：数据管理。
王太平：写作——初稿。
金峰：概念化。
于书娟：写作——审阅与编辑。
利益冲突
作者声明，本研究是在没有任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
利益冲突声明
对于本手稿，所有作者声明没有需要披露的利益冲突。具体来说，不存在以下类别的任何关系或活动：就业、咨询、股权所有权、酬金、付费专家证词、专利申请或注册、资助，或作为编辑或编委会成员与期刊的关联。作者确认手稿的内容未受到任何影响
