《FEBS Letters》：Chemical biology approaches to study and target circadian clocks and their components
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这篇综述聚焦于化学生物学工具在昼夜节律研究中的应用。文章系统性地阐述了如何利用小分子、共价标签和可检测的报告系统（如荧光/生物发光蛋白、Halo/SNAP/CLIP-tag、基因密码子扩展等）来追踪、修饰和操控果蝇与哺乳动物模型中的核心钟蛋白（CCPs）。这些工具极大地推动了我们对分子钟工作机制、蛋白动态、相互作用及其在相关疾病中作用的理解，并为开发靶向昼夜节律紊乱的治疗策略提供了新思路。
在生命的节拍器深处，存在着一个精密的计时系统——昼夜节律钟。它如同生物体内的“守时官”，驱动着大约24小时的生理与行为周期，使生物能够预测并适应地球的自转。从分子层面看，这些节律由细胞内的分子钟产生，其核心是转录/翻译反馈回路，它们调控着基因活动和蛋白质生产。然而，要深入理解这个动态系统的运作细节，传统遗传学方法往往力有未逮，特别是在直接探究蛋白质状态、相互作用和实时动态方面。这正是化学生物学大展身手的舞台。
化学生物学与昼夜节律钟概述
化学生物学站在化学与生物学的交界处，它利用化学原理和方法来研究和操控生命系统。其核心信条之一是开发分子工具，以精准的方式探究和影响生物过程。该领域催生了多种创新技术，包括生物正交化学、共价与可逆标记以及基于小分子的策略，这些技术为探索昼夜节律钟等复杂、振荡的系统提供了独特而强大的手段。尽管标准遗传工具在发现钟控基因及其层级方面功不可没，但它们大多偏向于转录输出，难以直接提供关于蛋白质状态、翻译后修饰调控、复杂动力学和内源性蛋白行为的信息。化学生物学方法，如共价标签系统、邻近标记和设计型小分子，以其时空控制的精确性，成为了研究高度动态的昼夜节律钟（包括核心钟蛋白）的理想工具。
果蝇与哺乳动物的昼夜节律分子机制
尽管分子钟的基本框架在物种间具有保守性，但果蝇和哺乳动物的系统在具体组分和调控细节上存在差异。两者都 fundamentally 由转录翻译反馈回路主导。
在果蝇模型中，核心反馈回路由正臂和负臂构成。正臂由Clock:Cycle异源二聚体组成，它们结合到靶基因启动子的E-box基序上，激活period和timeless等基因的转录。产生的PER和TIM蛋白在细胞质中积累，经历翻译后修饰（如Doubletime介导的磷酸化），形成二聚体后进入细胞核。在核内，PER:TIM复合物与CLK:CYC相互作用，抑制其转录活性，从而完成一个约24小时的负反馈循环。光照可通过隐花色素和E3连接酶Jetlag导致TIM快速降解，重置生物钟。
在哺乳动物模型中，核心反馈回路同样包含正负臂。正臂由CLOCK:BMAL1异源二聚体构成，它们结合E-box，驱动Period和Cryptochrome家族基因的转录。产生的PER和CRY蛋白形成复合物，经CK1δ/ε等激酶磷酸化后入核，抑制CLOCK:BMAL1的活性，完成反馈循环。CRY蛋白随后被FBXL3/FBXL21等E3泛素连接酶识别并降解，解除抑制，开启新的周期。一个次要的、互锁的反馈回路涉及ROR和REV-ERB蛋白，它们通过结合RORE元件来激活或抑制Bmal1的转录，帮助设定节律的相位和振幅。
基因编码标签与报告系统研究昼夜节律组分
为了追踪核心钟蛋白并剖析其功能，研究人员开发了多种基因编码标签和报告系统。这些工具使得在单细胞或组织分辨率下评估动态的钟蛋白行为成为可能。
荧光蛋白是其中应用最广泛的工具之一。它们被融合到各种核心钟蛋白上，用于实时监测蛋白表达、亚细胞定位、转运和稳定性。例如，将Venus融合到BMAL1上，结合荧光漂白恢复技术，可以可视化BMAL1在视交叉上核和周围组织中的定位、核质移动性、分子丰度和半衰期。研究表明，BMAL1具有较长的蛋白半衰期，提示CLOCK:BMAL1的节律性输出主要由PER/CRY的时间依赖性结合驱动，而非BMAL1蛋白水平的大幅振荡。类似地，PER2::Venus小鼠模型被用来研究PER2的核输入速率，并发现其核质穿梭依赖于CK1。在果蝇中，利用PER-CFP和TIM-YFP进行荧光共振能量转移成像，揭示了细胞质中PER:TIM复合物快速形成焦点，并在进入细胞核时解离的动态过程。
生物发光报告系统，特别是萤火虫荧光素酶系统，是追踪昼夜节律振荡的金标准。它们具有高灵敏度、低背景和出色的时间分辨率，非常适合长时间监测节律。基于Per2和Bmal1启动子的荧光素酶报告系统已成为可靠的化学生物学平台，广泛应用于细胞和体内模型，用于发现和表征能够调节昼夜节律振荡的小分子或生物分子。这些系统支撑了许多高通量筛选工作，寻找能够改变节律周期、相位或振幅的化合物。生物发光共振能量转移技术则被用于研究蛋白质-蛋白质相互作用，例如揭示CRY1/2蛋白通过物理干扰参与多巴胺D1受体的G蛋白抑制过程。
新一代的荧光素酶系统，如NanoLuc，提供了更亮的输出、更好的稳定性和更小的尺寸，虽然目前在昼夜节律研究中的应用报道还较少，但其在蛋白相互作用研究和基于细胞的热位移分析等应用中已展现出潜力。
可共轭的蛋白标签
除了基因编码的荧光/发光蛋白，可共轭的蛋白标签系统为蛋白质的特异性标记和操控提供了另一条强大途径。
HaloTag是一个自标记蛋白标签，它能与带有氯烷烃功能基团的合成配体发生不可逆的共价反应。由于其细菌起源，在真核系统中具有极高的特异性。HaloTag已被广泛应用于研究REV-ERBα等核受体。通过CRISPR/Cas9将HaloTag敲入REV-ERBα基因的N端，研究人员建立了不依赖抗体的染色质免疫沉淀测序方法，绘制了小鼠肝脏中数千个REV-ERBα的结合位点，并证明其通过直接结合DNA发挥主要功能。此外，利用HaloTag结合荧光蛋白，研究人员还可视化了REV-ERBα通过其内在无序区域驱动的液-液相分离过程，这种冷凝物的节律性组装与解离与其转录抑制功能相一致。
SNAP-tag和CLIP-tag是另一对正交的自标记蛋白标签，分别源自人类DNA修复酶。SNAP-tag特异性共价标记苄基鸟嘌呤衍生物，而CLIP-tag标记苄基胞嘧啶衍生物。它们的大小约为20kDa，为蛋白质提供了模块化和灵活的标记方案，可用于多色成像、超分辨显微镜和蛋白质相互作用研究。与HaloTag类似，它们能够实现位点特异性、共价的标记，为在活细胞和体内精确研究蛋白质提供了强大工具。
基因密码子扩展技术允许在蛋白质特定位点插入非经典氨基酸。这些ncAA可以携带叠氮化物或炔烃等生物正交手柄，随后通过点击化学与带有互补手柄的荧光团或小分子连接。这种方法实现了在单个特定位点对蛋白质进行精准修饰，为研究蛋白质翻译后修饰、构象变化和特定残基功能提供了前所未有的分辨率。
靶向昼夜节律蛋白的小分子
除了用于“观察”的工具，化学生物学还提供了“操控”昼夜节律钟的手段——设计能够与特定钟蛋白相互作用并调节其功能的小分子。
针对CRY蛋白，已发现多种小分子调节剂。KL001及其衍生物能结合CRY的蝶呤结合口袋，稳定CRY蛋白，延长生物钟周期。相反，GO289则通过结合CRY的C端，抑制CK1δ/ε对CRY的磷酸化，从而稳定CRY并增强其抑制活性，导致周期缩短。这些分子作为化学探针，揭示了CRY磷酸化在调节其稳定性、核定位和转录抑制活性中的关键作用。
针对CK1δ/ε，已开发出多种抑制剂。PF-670462和长滨霉素是选择性抑制剂，能延长细胞和动物模型的昼夜节律周期。而化合物SGC-CK2-1则被设计用于靶向CK2，揭示了CK2在PER蛋白磷酸化和果蝇生物钟计时中的重要作用。
针对BMAL1，化合物C1被鉴定为一种抑制剂，它通过结合BMAL1的PAS-B结构域，干扰CLOCK:BMAL1异源二聚体的形成，并抑制其转录活性。
针对REV-ERB核受体，已开发出合成激动剂如SR9009和SR9011，以及拮抗剂SR8278。这些化合物通过调节REV-ERB的转录共抑制因子募集来发挥作用，在动物模型中显示出调节代谢和睡眠-觉醒行为的功效。
结论与未来展望
化学生物学方法彻底改变了我们对昼夜节律钟的研究方式。从用于实时观测的荧光/生物发光报告系统和自标记蛋白标签，到用于精确操控的基因密码子扩展和设计型小分子，这些工具使我们能够以前所未有的时空分辨率探究钟蛋白的动态、相互作用和功能。它们不仅加深了我们对昼夜节律基本机制的理解，揭示了如液-液相分离、翻译后修饰动态等新层面，还为开发靶向生物钟紊乱相关疾病的治疗策略铺平了道路。
展望未来，这个领域充满机遇。开发具有更高亮度、光稳定性和组织穿透性的新型报告分子和标签系统，将实现更深层、更长时间的体内成像。结合CRISPR筛选、蛋白质组学和人工智能，可以系统性地发现新的钟蛋白调节剂和相互作用网络。而开发具有组织特异性或时间特异性递送能力的小分子，则有望实现更精准的节律调节，为治疗睡眠障碍、代谢综合征、癌症等与昼夜节律失调密切相关的疾病带来新的希望。总之，化学生物学与昼夜节律生物学的交叉融合，正持续推动着这一领域向更基础、更转化、更精准的方向蓬勃发展。
