非线性阳离子树状水凝胶作为对抗耐药性感染的先进伤口敷料

《Polymer》：Nonlinear Cationic Dendritic Hydrogels as Advanced Wound Dressings Against Drug-Resistant Infections

树状水凝胶通过调节交联剂比例实现抗菌性能优化，体外对革兰氏阳性/阴性菌均有效，体内猪皮模型和鼠伤口模型细菌存活率分别低于0.12%和0.47%，兼具高稳定性与生物相容性。

　　

作者：范彦苗（Yanmiao Fan）、玛丽亚·萨马拉（Maria Samara）、宋子瑜（Ziyu Song）、冯成（Cheng Feng）、丁子轩（Zixuan Ding）、阿梅内·阿亚内（Amene Ayane）、乔治奥斯·A·索蒂里乌（Georgios A. Sotiriou）、刘万军（Wanjun Liu）、迈克尔·马尔科赫（Michael Malkoch） 瑞典斯德哥尔摩皇家理工学院化学科学与工程学院，纤维与聚合物技术系，Teknikringen 56-58，SE-100 44

摘要

阳离子树状水凝胶在治疗耐药细菌方面显示出巨大潜力。在本研究中，通过第五代氨基功能线性-树状共聚物与N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化的PEG交联剂之间的非化学计量反应制备了自交联的树状水凝胶。研究了两种类型的交联剂：含有酯键的NHS活化PEG（PEG-NHS-est）和含有酰胺键的NHS活化PEG（PEG-NHS-ami）。这种细微的结构差异使得可以控制水凝胶的稳定性，从而显著影响其抗菌活性和细胞毒性。含有PEG-NHS-ami的水凝胶由于酰胺键具有更强的抗水解能力而表现出更高的稳定性。通过调整PEG-NHS-ami与PEG-NHS-est交联剂的比例，可以调节水凝胶网络以实现优异的抗菌活性、良好的生物相容性和持久的抗菌效果。经过不同配方的筛选，使用1:1比例的两种交联剂制备的水凝胶在体外猪皮模型中将MRSA感染减少了99.12%。在体内小鼠伤口感染模型中，经过水凝胶处理后的伤口细菌存活率为0.47%。此外，这些阳离子水凝胶能够很好地附着在猪皮和商业伤口敷料上，剪切粘附强度范围为9.65至23.68 kPa。这些结果表明，稳定性可控的树状水凝胶是治疗细菌性皮肤感染的有希望的候选材料。

引言

抗生素耐药性，也被称为“无声的流行病”，是对人类健康的主要威胁之一，2020年导致130万人死亡，预计到2050年这一数字将上升至1000万人。(1), (2) 然而，抗生素仍然是医院、兽医医学、水产养殖和农业中最常用的抗微生物感染药物。抗生素的广泛使用将加速抗生素耐药性的发展。耐药性葡萄球菌、肠球菌和链球菌是主要的病原体，它们对多种抗生素具有抗性，导致更高的发病率、死亡率和医疗成本。(3) 需要迫切减缓或控制耐药细菌的传播，并开发替代治疗方法。(4) 外科伤口容易受到细菌感染和生物膜的影响，如果病原体具有多重耐药性，后果可能非常严重，而且生物膜极难清除，会延缓愈合过程并增加感染风险。(5), (6) 人们一直在努力开发无抗生素的材料。潜在的非抗生素疗法包括抗菌肽（AMPs）、抗体、益生菌、噬菌体疗法、纳米材料和抗菌聚合物材料。(7), (8), (9), (10), (11), (12) 在潜在的抗菌替代品中，由三维（3D）聚合物网络组成的水凝胶在生物医学、制药、生物技术、生物分离、卫生纸尿裤、生物传感器、超级电容器、农业、石油回收和化妆品领域显示出巨大潜力。(13), (14), (15), (16) 它们已被用于治疗局部伤口感染和生物膜。(17) 由于其良好的生物相容性、可生物降解性和高含水量，水凝胶在生物医学应用中具有很大潜力。(18) 它们已被商业化，用于伤口敷料、化妆品应用、隐形眼镜和药物递送载体。(19) 目前有趋势开发具有多种功能的智能伤口敷料水凝胶，包括抗菌性能、粘附性、止血、抗炎和抗氧化、物质递送、自愈和响应刺激等功能。(20) 通过引入抗菌基团，可以调节水凝胶的抗菌活性。(21), (22), (23) 天然聚合物如壳聚糖和聚-ε-赖氨酸本身具有抗菌活性，基于天然聚合物的水凝胶也表现出抗菌性能。(17) 然而，使用天然聚合物制备水凝胶存在一些缺点，如机械性能不理想和加工性能较差。(24) 合成聚合物具有易于修改和可调节物理化学性质的优点，可以通过引入抗菌基团（例如阳离子胺基团、季铵盐和N-卤胺）来赋予其抗菌活性。(25), (26) 合成聚合物单独或与天然聚合物结合也可用于制备抗菌水凝胶。(27), (28) 在合成聚合物中，高分支树状聚合物（HDPs）因其丰富的表面官能团、较低的粘度和与细胞的多元相互作用而受到越来越多的关注。(29) 基于2,2-双(羟甲基)丙酸的HDPs具有成本效益，可以大规模合成并保持优异的批次间一致性。这些特性对于实际生物医学应用和潜在的商业化非常重要。此外，由于酯键的水解，这些聚合物具有良好的生物相容性和可降解性。(30), (31) 为了模仿抗菌肽（AMPs），双-MPA树状聚合物被不同氨基酸或小阳离子分子功能化，赋予聚合物优异的广谱抗菌活性；(23), (32) 用这些氨基功能聚合物制备的水凝胶无需额外添加抗菌剂即可表现出抗菌活性。(23), (33) 在本研究中，我们制备了具有天然抗菌活性的阳离子树状水凝胶，并使用不同的交联剂来调节水凝胶的稳定性及其对物理化学性质（如膨胀率、机械性能和降解性）的影响。通过体外实验评估了其对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌（S. aureus）和革兰氏阴性大肠杆菌（E. coli）及铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的抗菌效果。这些抗菌水凝胶对革兰氏阳性和阴性细菌菌株都非常有效，包括耐药菌株MRSA。优化后的水凝胶还在体外猪感染模型和体内小鼠感染模型中得到了验证，进一步证实了其在治疗感染动物模型中的有效性。

材料

聚乙烯二醇（PEG）PEG10K-OH、磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4，总离子浓度约为0.15 M）、N-羟基琥珀酰亚胺、氟化铯、β-丙氨酸和三氟乙酸（TFA）均购自Sigma-Aldrich。2,2-双(羟甲基)丙酸（bis-MPA）购自瑞典Perstorp AB。PEG10K-NHS-ami购自Iris Biotech。Boc-β-丙氨酸购自Alfa Aesar。1,1'-羰基二亚胺（CDI）购自Carbosynth。

氨基-HBDLDs和阳离子水凝胶的合成

根据先前发表的协议，合成了PEG10K-G5-NH₃⁺（PEG长度为10kDa，第五代），详细合成步骤见补充数据。图S1和图S2展示了羟基功能PEG10K-G5-OH的¹H NMR和¹³C谱，通过质子NMR和尺寸排阻色谱（SEC）数据确认了聚合物达到了预期的代数。(1)

结论

总之，使用PEG10K-G5-NH₃⁺和两种PEG交联剂PEG-NHS-ami及PEG-NHS-est合成了一系列阳离子树状水凝胶，这些交联剂能够调节水凝胶的稳定性、抗菌活性和细胞毒性。使用稳定的PEG-NHS-ami交联剂提高了水凝胶的稳定性并降低了其膨胀率。通过在制备水凝胶过程中同时使用这两种交联剂，可以调节水凝胶的性能以达到最佳效果。

CRediT作者贡献声明

乔治奥斯·索蒂里乌（Georgios Sotiriou）：撰写、审稿与编辑、验证、监督、资源管理、项目管理、研究设计、资金获取、概念构思。 刘万军（Wanjun Liu）：撰写、审稿与编辑、监督、资源管理、方法学研究、研究实施。 丁子轩（Zixuan Ding）：数据分析、数据管理。 阿梅内·阿亚内（Amene Ayane）：资源管理、方法学研究、数据管理。 冯成（Cheng Feng）：数据可视化、结果验证、方法学研究、数据分析。 玛丽亚·萨马拉（Maria Samara）：撰写。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者感谢Knut和Alice Wallenberg基金会（2017-0300）、瑞典战略研究基金会（SSF）（FFL18-0043）以及瑞典研究委员会（2024-06193、2024-06173、2023-03057、2021-06397、2021-05494和2021-02059）的财政支持。作者还感谢中国国家自然科学基金（编号32271422、32311530766）的资助。所有动物实验均在伦理批准后进行。