靶向CD70的CAR NK细胞：应对高危多发性骨髓瘤及BCMA治疗耐药的创新策略

《Blood Cancer Discovery》：Phenotypic characterization of CD70 expression in patients with multiple my... Open Access

本研究针对高危多发性骨髓瘤（MM）及对BCMA靶向治疗后复发患者缺乏有效治疗手段的临床难题，系统评估了CD70作为新型治疗靶点的潜力。研究人员通过多组学数据分析和临床样本验证，证实CD70在高危MM及t(4;14)等特定遗传学异常的患者中高表达，且与不良预后相关。在此基础上，他们开发了工程化的CAR27/IL-15 NK细胞，并在体外及异种移植小鼠模型中证实，该疗法可有效清除CD70+MM细胞，且在BCMA敲除模型中依然有效，为解决BCMA耐药难题提供了强有力的临床前支持，并为正在进行中的I/II期临床试验(NCT05092451)奠定了科学基础。

　　

在血液肿瘤领域，多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma, MM）是第二大常见的血液系统恶性肿瘤。尽管近年来治疗手段取得了显著进步，但它仍然是一种无法治愈的疾病。特别是那些携带特定高危细胞遗传学异常，或对现有治疗产生耐药/复发（Relapsed/Refractory MM, RRMM）的患者，其治疗前景尤为严峻。即便是采用高剂量化疗和自体干细胞移植，挑战依然巨大。以B细胞成熟抗原（BCMA）为靶点的嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor, CAR）T细胞疗法已被FDA批准，在MM治疗中展现出高客观缓解率，为患者带来了希望。然而，CAR-T疗法本身也面临诸多挑战：自体CAR-T产品制备成本高昂、流程复杂；存在移植物抗宿主病（Graft-versus-host Disease, GVHD）风险；并可能引发细胞因子释放综合征、免疫效应细胞相关神经毒性综合征等治疗相关毒性。更关键的是，多数接受BCMA靶向CAR-T治疗的MM患者最终仍会复发。对于BCMA靶向治疗后进展的患者，目前尚无标准的治疗选择。因此，开发有效、安全且可及的新疗法，尤其是针对高危、耐药患者，成为临床亟待解决的难题。本研究正是瞄准这一痛点，探索新的治疗靶点和创新的细胞治疗策略，相关成果已发表在《Blood Cancer Discovery》期刊。

为了回答这些问题，研究人员综合运用了多组学数据分析、单细胞测序、流式细胞术、免疫组化、基因编辑以及体内外功能验证等多种关键技术。他们首先利用多发性骨髓瘤研究基金会的CoMMpass数据库，对大量新诊断MM患者的RNA测序数据进行生物信息学分析，以评估CD70的表达与临床特征和预后的关联。同时，他们从MD安德森癌症中心收集了健康供者和MM患者的骨髓样本，通过单细胞RNA测序和流式细胞术，在单细胞水平验证CD70在MM细胞中的表达谱。在功能研究方面，他们构建了靶向CD70的CAR NK细胞（CAR27/IL-15），通过⁵¹铬释放试验、实时活细胞成像杀伤试验等体外方法评估其抗肿瘤活性。他们还利用CRISPR/Cas9技术敲除了MM细胞系中的BCMA基因，构建了BCMA耐药模型。最后，通过在NOD/SCID/IL2rγ^null小鼠体内建立MM异种移植模型，并通过生物发光成像长期监测，系统地评估了CAR27/IL-15 NK细胞在体内的抗肿瘤效果、持久性和安全性。

研究结果

CD70在多发性骨髓瘤CoMMpass数据集中的表达

研究人员在MMRF CoMMpass数据集中分析发现，CD70 mRNA在不同风险分组的MM患者中表达水平不同。在国际骨髓瘤工作组定义的高危细胞遗传学患者中，如t(4;14)、t(14;16)、1q扩增和17p缺失的患者，其CD70 mRNA水平显著高于t(11;14)易位患者。此外，国际分期系统（International Staging System, ISS）2期或3期的晚期疾病患者，其CD70 mRNA水平也显著高于ISS 1期患者。对61名患者的配对样本分析显示，复发时的CD70 mRNA表达水平显著高于诊断时。当将所有新诊断MM患者按CD70 mRNA表达水平分层后，表达水平最高的三分之一患者其总体生存概率显著低于表达水平最低的三分之一患者。这些数据表明，CD70 mRNA表达与MM患者的临床结局相关，尤其是在具有高危细胞遗传学特征和复发疾病的患者中。

验证CD70 mRNA在多发性骨髓瘤中的表达

为了进一步验证CoMMpass数据集的发现，研究人员对来自健康供者和具有免疫球蛋白重链相关易位的MM患者的骨髓样本进行了单细胞RNA测序。通过伪批量计数分析CD70 mRNA，他们观察到t(4;14)患者的CD70 mRNA水平显著高于t(11;14)患者。单细胞水平的可视化分析也证实了CD70表达与t(4;14)易位的强相关性。有趣的是，CD70阳性细胞簇与高表达NSD2（核受体结合SET域蛋白2）的细胞簇高度相关。

骨髓瘤中CD70的表面表达

通过流式细胞术分析30例连续MM患者的骨髓样本，研究人员发现在CD138⁺骨髓瘤细胞中，有相当一部分患者表现出高水平的CD70表面蛋白表达。尽管在复发患者中观察到CD70表达有更高的趋势，但差异无统计学意义，这可能与样本量较小有关。免疫组化分析进一步证实了CD70在各种MM组织样本中的高表达，包括一名对BCMA抗体偶联药物Belantamab Mafodotin治疗无效的患者。这些数据共同证明，CD70蛋白在MM样本中高表达，包括高危和复发疾病，加强了其作为MM治疗靶点的潜力。

靶向CD70的CAR NK细胞在体外显示出强大的抗骨髓瘤活性

研究人员构建了表达CAR27/IL-15的脐带血来源NK细胞。体外杀伤实验表明，与非转导的NK细胞相比，CAR27/IL-15 NK细胞对CD70阳性的MM.1S细胞具有显著更强的细胞毒性。这种强大的抗骨髓瘤活性在针对另一个CD70阳性的骨髓瘤细胞系U266B1的长期实时杀伤实验中也得到了证实。此外，与MM.1S细胞共培养时，CAR27/IL-15 NK细胞表现出更高的脱颗粒和效应细胞因子产生。

CAR27/IL-15 NK细胞在多发性骨髓瘤小鼠模型中的体内活性

在MM.1S细胞异种移植小鼠模型中，与未治疗组或接受对照NK细胞治疗的组相比，接受单次CAR27/IL-15 NK细胞输注的小鼠肿瘤负荷显著且持续地降低。CAR27/IL-15 NK细胞治疗不仅控制了肿瘤生长，还延长了小鼠的生存期，且未观察到明显的毒性。

CAR27/IL-15 NK细胞对BCMA缺失的多发性骨髓瘤细胞仍保持细胞毒性

为了模拟BCMA治疗失败，研究人员使用CRISPR/Cas9敲除了MM.1S细胞中的TNFRSF17基因。重要的是，BCMA敲除细胞仍保持CD70表达。体外细胞毒性实验证实，CAR27/IL-15 NK细胞能有效杀死BCMA敲除的MM.1S细胞。在BCMA敲除的MM.1S异种移植模型中，CAR27/IL-15 NK细胞治疗同样显著降低了肿瘤负荷，延长了小鼠生存期，且无毒性迹象。这些发现强调了靶向CD70的CAR NK细胞即使在缺乏BCMA表达的情况下，对骨髓瘤依然有效，凸显了其作为BCMA靶向治疗后复发或进展患者治疗选择的潜力。

CAR27/IL-15 NK细胞显示出与CAR27/IL-15 T细胞相当的抗多发性骨髓瘤活性