通过手性纳米辅助剂同时调节NLRP3炎性体途径和cGAS-STING途径来重新编程抗肿瘤免疫

《Science Bulletin》：Reprogramming anti-tumor immunity through both NLRP3 inflammasome and cGAS-STING pathways by chiral nanoadjuvants

肿瘤免疫治疗中可降解的左旋三锰四氧化物纳米颗粒通过NLRP3炎症小体和cGAS-STING途径激活树突状细胞，调控CCL5/CCL22平衡增强抗肿瘤免疫应答，并在PDX模型中验证临床潜力。

　　

陈盼盼|王伟伟|曲爱华|华一辉|杰西卡·克里斯蒂安娜·马加利亚内斯·耶里希|安德烈·法里亚斯·德·莫拉|徐立光|匡华|徐传来|孙茂忠

摘要

癌症免疫疗法显示出巨大的潜力，但由于安全性问题、复杂的肿瘤微环境以及癌症疫苗的低免疫原性，仍面临诸多挑战。本文报道了一种可降解的手性四氧化三锰纳米颗粒（Mn₃O₄ NPs）的合成方法，该方法通过修饰手性甘露糖配体来制备用于癌症治疗和预防的手性疫苗。与D-型Mn₃O₄纳米颗粒（D-NPs）相比，L-型Mn₃O₄纳米颗粒（L-NPs）能够以几乎两倍的速率被小鼠骨髓树突状细胞（BMDCs）摄取，这得益于其对X-C基序趋化因子配体1（XCR1）、分化簇14（CD14）和Toll样受体4（TLR4）的更高亲和力。当这些纳米颗粒装载肿瘤抗原作为疫苗（L-Vac）使用时，它们通过NOD样受体蛋白3（NLRP3）炎性体通路和环状GMP-AMP合成酶-干扰素基因刺激因子（cGAS-STING）通路激活BMDCs，从而增强C-C基序趋化因子配体5（CCL5）的水平并降低C-C基序趋化因子配体22（CCL22）的表达。分子动力学（MD）模拟揭示了手性纳米颗粒与抗原之间的锁钥式相互作用机制。值得注意的是，在患者来源的异种移植（PDX）小鼠模型中成功验证了其抗肿瘤免疫效果，展示了这类手性疫苗的临床潜力。L-Vac在体内具有较高的生物安全性，最终分解为锰离子并通过粪便排出。因此，手性佐剂有望为癌症免疫疗法开辟新的途径。

引言

免疫疗法是一种有前景的癌症治疗策略，因为它能够引发针对肿瘤的特异性免疫反应并产生长期免疫记忆，从而抑制或预防肿瘤生长、转移和复发[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]。然而，癌症疫苗的临床应用仍面临诸多挑战。肿瘤会采取多种机制逃避免疫系统的攻击[10]、[11]、[12]，例如通过丢失肿瘤抗原特异性主要组织相容性复合体I类（MHC I）[13]、[14]、[15]来隐藏自己，分泌细胞因子抑制免疫反应，或表达负性共刺激分子（如程序性死亡配体1（PD-L1）和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）等）来抑制免疫细胞的激活[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]。因此，开发既能引发强烈肿瘤特异性免疫反应又无副作用且能防止肿瘤免疫逃逸的疫苗至关重要。

佐剂在肿瘤抗原的递送和免疫系统的激活中起着关键作用[22]、[23]。铝盐是常用的免疫佐剂，但由于其引发的细胞免疫反应有限，其在抗肿瘤或抗病毒应用中的效果受到限制[24]。因此，亟需具有生物安全性和强大细胞免疫反应及体液免疫反应的新型佐剂。随着纳米技术的发展，纳米材料被广泛用于调节生命功能，并在科学工程化后适合作为佐剂[25]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]、[33]、[34]、[35]、[36]、[37]、[38]、[39]。

近年来，手性纳米颗粒（NPs）因能与生物系统发生有效的手性特异性相互作用而受到广泛关注[40]、[41]、[42]、[43]、[44]、[45]。手性是核酸、肽和碳水化合物等生物活性物质的重要特性，而手性选择性是生物系统维持正常生命功能的关键能力[46]。纳米材料的手性会影响其与生物系统的亲和力；因此，一系列手性纳米材料被设计用于生物传感器[47]、疾病治疗[48]以及免疫调节[49]、[50]、[51]。然而，尽管取得了数十年的进展，手性纳米颗粒的应用仍受到关键限制，大多数现有平台的功能过于单一，无法应对抗肿瘤免疫的系统性复杂性。这种碎片化现象在两个主要研究范式中尤为明显：一种是专注于单一生物靶点或递送功能，另一种则忽视了多途径协调的必要性。部分研究集中于激活特定免疫通路（如炎性体介导的抗原呈递、增强（白细胞介素-1β）IL-1β的分泌和肿瘤抗原的交叉呈递[50]，但这些系统缺乏调控趋化因子网络的能力，而趋化因子网络对免疫细胞在肿瘤微环境（TME）中的迁移和浸润至关重要。以递送为导向的手性系统则侧重于抗原封装和靶向细胞摄取，但严重依赖外部刺激来激活免疫系统[52]、[53]。总体而言，这些碎片化的方法阻碍了多功能手性平台的开发，这些平台应能够协调先天性和适应性免疫，重塑肿瘤微环境，并确保持续的免疫激活，因此迫切需要新一代手性纳米材料，以实现多途径调节、自主生物活性和系统性免疫协调，从而弥合基础研究与临床应用之间的差距。

本文开发了一种手性疫苗，其中负载抗原的手性Mn₃O₄纳米颗粒（L-NPs）通过NOD样受体蛋白3（NLRP3）炎性体和环状GMP-AMP合成酶-干扰素基因刺激因子（cGAS-STING）通路激活骨髓来源的树突状细胞（BMDCs），从而增强抗原的捕获和BMDCs的抗原交叉呈递。值得注意的是，L-Vac比D-Vac或DL-Vac更能有效激活BMDCs，增强C-C基序趋化因子配体5（CCL5）的分泌并降低C-C基序趋化因子配体22（CCL22）的表达。体内实验数据显示，L-Vac能够引发更强的肿瘤特异性免疫反应，抑制肿瘤免疫逃逸，从而用于癌症预防和治疗；同时调节性T细胞（Tregs）和PD-L1的水平显著下降，这通过患者来源的异种移植（PDX）模型得到了验证。重要的是，手性Mn₃O₄纳米颗粒可降解为锰离子，具有良好的生物相容性。

手性Mn₃O₄纳米颗粒的合成

Mn₃O₄纳米颗粒（NPs）通过一步法合成：首先将10 mL浓度为10 mmol L^?1的十六烷基三乙基铵溴化物（CTAB）与50 μL柠檬酸三钠混合，然后加入100 μL浓度为100 mmol L^?1的L-型或D-型或DL-型（L-型与D-型的混合物）甘露糖以及100 μL浓度为1 mmol L^?1的KOH。搅拌20分钟后，加入100 μL浓度为150 mmol L^?1的高锰酸钾（KMnO₄），6小时后获得Mn₃O₄纳米颗粒。

抗原负载能力评估

将手性Mn₃O₄纳米颗粒与抗原混合

手性Mn₃O₄纳米颗粒的合成与表征

手性Mn₃O₄纳米颗粒在室温下通过一步法合成，使用高锰酸钾（KMnO₄和柠檬酸三钠作为还原剂。在合成过程中，分别使用L-甘露糖、D-甘露糖或DL-甘露糖作为配体（L-甘露糖与D-甘露糖的混合物），得到L-型Mn₃O₄纳米颗粒（L-NPs）、D-型Mn₃O₄纳米颗粒（D-NPs）或DL-型Mn₃O₄纳米颗粒（DL-NPs）（详见补充材料方法部分）。

透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）观察了纳米颗粒的结构

结论

本研究开发了一种可降解的手性疫苗，用于癌症预防和治疗。研究发现，L-Vac通过NLRP3炎性体和cGAS-STING通路激活BMDCs，从而促进CCL5的表达并降低CCL22的分泌，增强CD8⁺ T细胞的浸润，抑制肿瘤组织中的PD-L1表达，进而抑制Tregs的浸润，从而实现肿瘤微环境的重塑，从而产生系统性的抗肿瘤免疫效应。

利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号51902136、22274067和22207045）和中央高校基本科研业务费（项目编号JUSRP622009）的支持。安德烈·法里亚斯·德·莫拉感谢国家科学技术发展委员会（项目编号311352/2022-7）和圣保罗研究基金会（FAPESP）通过分子工程先进材料研究中心（CEMol）提供的财政支持。