单细胞的多尺度化学图谱分析：利用同步辐射红外显微光谱技术解析内皮细胞的异质性

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Multiscale chemical cartography of single cells: Deconstructing endothelial heterogeneity with synchrotron infrared microspectroscopy

细胞异质性定量分析：同步辐射红外显微光谱与化学计量学联用揭示内皮细胞LPS刺激的时空代谢重编程机制。

李梦婷|李雪玲|卢诺菊|吕俊宏|王亚迪

山东医科大学药学院，中国烟台264003

摘要

细胞异质性是生物系统的基本特征，然而从细胞群体到亚细胞区室定量映射其生化基础仍然是一个重大挑战。在这里，我们介绍了一个综合分析框架，结合了同步辐射红外显微光谱和先进的化学计量学方法，以多层面分析内皮细胞的异质性。我们定量评估了细胞群体内的异质性，绘制了细胞内的空间异质性图谱，并解码了脂多糖（LPS）刺激的动态时空响应。我们的分析表明，LPS在群体水平上诱导了一种趋同的炎症状态。二维相关光谱分析表明，LPS刺激启动了一种主导的“由外向内”的炎症序列，改变了原本的“由内向外”的层次结构。这为早期炎症信号传导的时空动态和代谢重编程提供了机制上的见解。我们的研究建立了一种强大的无标记多尺度生化成像方法，可以应用于药理学、毒理学和疾病病理学中细胞功能和功能障碍的更广泛研究。

引言

细胞异质性是生物学的基石，它支撑了组织和对外界刺激反应的功能多样性[1]、[2]、[3]。这种异质性存在于多个尺度上：从细胞群体内单个细胞之间的差异（细胞间异质性）到单个细胞内的不同生化特征（细胞内异质性）[4]。内皮细胞作为血管内壁的细胞，是这一现象的典型例子，它们表现出显著的异质性，这决定了它们在健康和疾病中的作用[5]、[6]。因此，全面理解内皮细胞的病理生理学需要能够量化细胞间以及单个细胞内部空间结构中生化差异的分析工具[7]。然而，实现这种多尺度、无标记的生化映射是一个重大挑战。

传统的批量检测方法（如Western blotting）虽然提供了宝贵的生化数据，但由于报告的是群体平均值而掩盖了细胞间的差异[1]。虽然单细胞组学技术在基因组和转录组水平上改变了细胞间异质性的研究，但它们本质上是破坏性的，并且缺乏分析亚细胞区室所需的空间分辨率。此外，它们不能直接探测生物分子在其天然状态下的情况[2]、[6]。荧光显微镜提供了空间分辨率，但它依赖于特定的标记物，这些标记物可能会干扰实验结果，并将发现限制在预定义的目标上[3]、[8]。因此，迫切需要一种无标记技术，能够直接量化从群体、单细胞到亚细胞尺度范围内的基本生化组成[9]。

基于同步辐射的傅里叶变换红外（SR-FTIR）显微光谱技术被证明是解决这一挑战的有效方法。其卓越的亮度使得能够在不使用染色或标记物的情况下，实现通常为3–10 μm的衍射极限空间分辨率[10]、[11]。每个光谱都提供了采样区域的全面“化学指纹”[9]。然而，这些丰富的光谱数据的真正潜力只有通过先进的化学计量学分析才能被释放[12]。主成分分析（PCA）是一种强大的无监督方法，可以用来提取复杂光谱数据集中的主要变异来源，并客观量化异质性[13]、[14]。为了提供一个定量且直观的细胞多样性指标，我们基于单细胞光谱之间的欧几里得距离计算了一个异质性指数（HI），这一方法在我们之前的工作中已经得到了验证[15]、[16]。较高的HI值表示细胞群体内的异质性更大。为了超越静态快照并研究动态生化过程，二维相关光谱（2D-COS）非常强大[17]、[18]。尽管它传统上用于追踪时间变化，但2D-COS也可以沿样本中的空间向量应用。这种空间2D-COS方法提高了光谱分辨率，并揭示了沿物理梯度的分子变化序列。这为在静态快照中解读定向生化过程和层次结构提供了独特的方法[19]、[20]。

在这项研究中，我们整合了这些技术，建立了一个用于内皮细胞多尺度化学制图的统一框架。我们证明了SR-FTIR、PCA、HI和2D-COS的结合提供了一个全面的工具包，用于解构细胞异质性。我们首先应用这一框架来量化内皮细胞群体内的固有细胞间异质性。然后，我们使用它来绘制单个细胞内细胞核、细胞质和膜的独特生化特征。最后，我们通过让细胞暴露于脂多糖（LPS）这一动态测试来验证该框架的有效性。利用空间2D-COS，我们揭示了生化变化的时空序列，为炎症信号传导的动态提供了新的视角。我们的工作不仅为内皮细胞的生化特性提供了新的见解，还展示了一种可以应用于各种生物系统的通用分析方法。

章节片段

用于探测细胞异质性的多尺度分析框架

为了系统地解析LPS诱导的内皮细胞生化变化，我们建立了一个综合的分析工作流程，将基于同步辐射的FTIR显微光谱与一系列化学计量学分析方法相结合（图1）。该框架旨在从三个关键维度研究细胞异质性：（i）细胞群体内的细胞间异质性，（ii）单个细胞内的细胞内空间异质性，以及（iii）时间变化

结论

我们的多尺度分析提供了对内皮细胞对LPS反应的深入、无标记的视图。在群体水平上，LPS作为一种强大的均质化剂，减少了细胞间的差异，使群体趋向于更统一的炎症状态，这一点通过降低的HI值和更紧密的PCA/HCA聚类得到了定量验证。这种群体层面的趋同可能反映了TLR4/NF-κB通路的同步激活[34]、[35]。然而，在单细胞层面，

细胞培养和LPS处理

原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs，AllCells，上海）在完全培养基（AllCells；不含补充成分）中培养，温度为37°C，二氧化碳浓度为5%，湿度饱和。LPS（来自大肠杆菌 O55:B5）在生理盐水中制备。当细胞达到70–80%的汇合度时，将细胞暴露于最终浓度为1 μg/mL的LPS中6小时；对照组细胞仅接受生理盐水[36]。所有实验包括三个独立的生物重复

作者贡献

J.L.构思并监督了这项研究。Y.W.和J.L.设计了实验。Y.W.、M.L.和N.J.进行了实验。J.L.、Y.W.和X.L.分析了数据。J.L.和Y.W.撰写了论文。X.L.修订了手稿。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

这项工作部分得到了烟台大学研究项目（YX25B005）的财政支持。我们感谢上海国家蛋白质科学设施（https://cstr.cn/31129.02.NFPS.BL01B）的BL01B光束线和上海同步辐射设施的BL06B光束线的工作人员，在数据收集和分析方面提供了技术支持和帮助。