通过OSMAC激活和HPLC-UV引导的方法，从内生真菌Phomopsis sp. LGT-5中定向发现生物活性次级代谢产物

《Biochemical Systematics and Ecology》：Targeted discovery of bioactive secondary metabolites from an endophytic fungus Phomopsis sp. LGT-5 by OSMAC-activated and HPLC-UV-guided isolation

本研究从 Tripterygium wilfordii 植物内生真菌 Phomopsis sp. LGT-5 中分离得到10种化合物，通过核磁共振和质谱确证结构。其中5种为 Phomopsis 属首次报道。化合物4、5、7、8、10对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌具有抗菌活性（MIC 10-80 μg/mL），化合物4和7在10 μM浓度下分别对流感A病毒（IC50 1.5 μM）和OC43冠状病毒（IC50 0.8 μM）表现出显著抑制活性。该成果为抗病毒药物研发提供了新资源。

　　

范文豪|王文倩|王玉佳|何文妮|安振宇|王磊|吴新媛|马健|吴秀丽|宋志军

宁夏医科大学药学院，教育部六盘山地区药用资源保护、开发与利用重点实验室，银川市，750004，中国

摘要

内生真菌是生物活性化合物和化学新颖化合物的丰富可靠来源，在药物研发中具有巨大的潜力。本研究从培养在稻米培养基上的内生真菌Phomopsis sp. LGT-5中分离出了十种化合物（1–10）。通过广泛的光谱分析（包括¹H NMR、¹³C NMR和ESI-MS）阐明了这些化合物的结构。其中，化合物4、5、7、8和10是首次从Phomopsis属中报道的。针对一系列病原菌的生物活性评估显示，化合物4、5、7、8和10对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌具有抗菌活性，最小抑菌浓度（MIC）范围为10至80 μg/mL。此外，在10 μM浓度下，化合物4和7表现出强效的抗甲型流感病毒（IAV）活性，其IC₅₀值分别为1.5 μM和0.6 μM。值得注意的是，化合物7在10 μM浓度下表现出强效的抗人类冠状病毒OC43活性，IC₅₀值为0.8 μM。这些发现为未来的抗病毒药物研发提供了有希望的先导化合物。

引言

天然产物作为重要的药物先导化合物，在药物发现和创新中发挥着关键作用（Newman和Cragg，2020）。例如，著名的抗癌药物紫杉醇已被临床用于治疗多种类型的癌症（Li等人，2024）；洋地黄毒苷用于治疗心力衰竭和某些类型的心律失常疾病（Chen等人，2024）；芒果苷被作为高血压和高血脂疾病的候选药物（Chen等人，2018）等。因此，探索天然产物的结构多样性和显著生物活性引起了研究人员越来越多的关注。

内生真菌是结构独特且具有生物活性的次级代谢产物的丰富可靠来源，具有直接或间接的药物潜力（Yu等人，2025）。特别是Phomopsis属产生了多种有价值的次级代谢产物，包括聚酮类（Sang等人，2017）、生物碱（Chen等人，2019）、萜类（Qu等人，2020）、甾体（Hu等人，2017）、黄酮类（Xu等人，2019）和细胞松弛素（Shen等人，2014），这些化合物表现出抗HIV（Yang等人，2013）、抗菌（Qu等人，2020）、细胞毒性（Sang等人，2017）、诱导一氧化氮合酶抑制活性（Hu等人，2017）等多种生物活性（Chen等人，2020；Li等人，2020；Yu等人，2022）。然而，目前对Phomopsis属的研究仅揭示了其代谢潜力的一小部分，许多天然产物尚未被探索。

我们的研究小组专注于从内生真菌库中发现新的生物活性化合物。在之前的工作中，我们从Tripterygium wilfordii Hook F.中分离出了内生真菌Phomopsis sp. LGT-5，通过抗菌实验、HPLC-Q-ToF-MS/MS以及基于GNPS的粗提物预测分析，证明了该真菌能够产生结构多样的生物活性次级代谢产物（Zhu等人，2023）。为了进一步探索其代谢潜力，我们采用了“一种菌株多种化合物”（OSMAC）策略来筛选最佳发酵培养基。结合HPLC分析代谢产物，我们在稻米培养基中发现了一组结构独特的聚酮类化合物。随后，我们使用稻米培养基进行发酵，并采用不同的色谱柱进行分离和纯化，最终鉴定出十种化合物，包括六种黄酮二聚体（4–8和10），如图1所示。进一步评估这些单体化合物的活性发现，其中一些化合物具有良好的抗菌和抗病毒活性。这些结果不仅丰富了这种真菌的次级代谢产物，还为抗菌和抗病毒药物的开发提供了活性先导分子。本文报告了这些化合物的分离、结构鉴定及其抗菌和抗病毒活性的评估。

实验方法概述

一般实验程序

¹H NMR（400 MHz）和¹³C NMR（100 MHz）光谱是在Varian System-400光谱仪（Varian Inc.，加利福尼亚州帕洛阿尔托）上记录的。化学位移（d）以ppm为单位，耦合常数（J）以赫兹（Hz）为单位。ESI-MS数据使用Waters TQ-S Cronos光谱仪（Waters，美国米尔福德）测量。柱层析（CC）使用了硅胶（200-300目，青岛海阳化工有限公司，中国青岛）和C₁₈凝胶（S-50 mm，日本YMC）。半制备型HPLC...

筛选最佳培养基

根据OSMAC策略使用六种不同的培养基，通过HPLC-UV代谢组学分析提取物，发现了不同的化学特征。其中，稻米培养基（培养基3）表现出最大的化学多样性，并含有独特的代谢物类别（图2）。这一独特性在色谱图中得到了直观验证，目标化合物的特征峰得到了明确显示。

结论

内生真菌是结构新颖且具有生物活性的天然产物的丰富来源，是药物的重要来源。本研究采用OSMAC方法在稻米培养基中培养内生真菌Phomopsis sp. LGT-5，成功激活了多种次级代谢产物的产生。基于峰强度和新颖性的HPLC-UV引导分离方法得到了十种化合物（1–10），其结构通过全面的光谱分析得到阐明。

作者贡献声明

范文豪：撰写 – 原稿。 王文倩：数据管理。 王玉佳：实验研究。 何文妮：实验研究。 安振宇：撰写 – 审稿与编辑。 王磊：数据分析。 吴新媛：方法学研究，数据分析。 马健：概念构思。 吴秀丽：撰写 – 审稿与编辑，监督，资金获取。 宋志军：撰写 – 审稿与编辑，监督，资金获取。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了宁夏省重点研发计划（2025BEH04090, 2022BEG03159）、宁夏自然科学基金（2024AAC03231, 2024AAC03267）以及宁夏医科大学的校级科研项目（XT2024016）的支持。我们感谢宁夏医科大学的医学科技研究中心（宁夏回族自治区医学科研机构）在实验中提供的宝贵帮助。