《Biomaterials Advances》：Evaluation of pH responsive chitosan derivatives for localised “smart” drug release, using novel microfluidic devices
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pH响应性壳聚糖衍生物的微流控平台评估及抗菌性能研究。通过合成七种zwitterionic/phenolic修饰的壳聚糖材料，利用动态pH模拟系统量化药物释放响应性（Rs），发现vanillin-交联混合物在酸性环境（pH5.5）中具备快速持久的释药特性。材料经MTT和生物反应器测试证实安全，并有效抑制口腔常见致病菌。
威廉·奥茨（William Oates）| 伊奥annis Tsamesidis | 乔治亚·米哈伊利杜（Georgia Michailidou）| 埃维·克里斯托杜卢（Evi Christodoulou）| 玛丽亚·布斯纳基（Maria Bousnaki）| 兰布里尼·帕帕多普洛（Lambrini Papadopoulou）| 迪米特里奥斯·比基阿里斯（Dimitrios Bikiaris）| 埃莱安娜·康托纳萨基（Eleana Kontonasaki）| 安东尼奥斯·D·阿纳斯塔西乌（Antonios D. Anastasiou）
曼彻斯特大学化学工程系复杂流体与微流控实验室，英国曼彻斯特，M1 9PL
摘要
局部“智能”药物输送系统（LDDs）为植入医疗设备周围的感染控制提供了一种有前景的策略。在这项研究中，通过使用两性离子或酚类单体（Amps、Sbma、Sba和香草醛）对壳聚糖进行功能化处理，合成了七种pH响应型壳聚糖衍生物，并在稳态和动态条件下对其药物释放性能进行了评估。该研究使用了一种新型微流控平台进行测试，该平台通过控制流速、pH值和液体与样品的比例来模拟体内微环境的关键方面。该平台能够同时评估材料在稳态和动态pH条件下的性能，并允许实时监测释放的药物浓度。药代动力学数据表明，所有材料在稳态（pH 7.5）和类似感染的环境（pH 5.5）下表现出不同的释放行为。为了量化材料对连续pH刺激的响应（药物释放的变化），引入了一个新的参数（响应性，Rs），并用于评估其作为智能药物输送系统的潜力。在所有候选材料中，香草醛交联混合物（Va-blend）在稳态下释放量较低，但在酸性条件下释放速度快且持续时间长，显示出最高的智能释放潜力。通过调整聚合物质量和药物负载量进一步优化了释放时间，同时通过MTT实验和与需氧细菌及人类牙周韧带细胞的微流控生物反应器测试确认了其生物相容性。在标准静态条件测试和生物反应器实验中均证明了其对细菌的有效抑制作用。总体而言，本文开发的材料、方法和工具在推动更有效的局部药物输送系统方面具有显著潜力。通过能够在生理相关动态条件下精确评估刺激响应的药物释放，所提出的微流控方法为加速下一代智能生物材料的设计和优化提供了强大的平台。
引言
感染是再生医学中的一个重要问题，它与多种医疗设备有关，从牙科植入物和冠状动脉支架到隐形眼镜[1]、[2]、[3]。感染可能由多种原因引起，例如手术过程中的污染、细菌通过开放性伤口渗透或细菌在血液中的循环。一旦微生物附着在植入设备的表面，它们会产生一种胞外聚合物物质（EPS），形成一层保护性生物膜，使它们对抗生素（抗菌性）和宿主免疫系统产生抗性，从而加剧抗菌性[4]、[5]。如果不加以治疗，愈合过程将受到损害，在严重情况下可能导致严重的并发症，甚至需要进一步的临床干预或危及生命[6]、[7]。解决这一问题的一个有前景的方法是开发用于局部输送活性物质的药物释放医疗设备，这种方法已被证明对其他情况（如癌症）非常有效[8]、[9]、[10]。在这种情况下，活性化合物（如抗生素、纳米颗粒）直接释放到植入物周围的微环境中，从而在早期阶段抑制细菌生长并防止生物膜的形成[11]、[12]。抗菌剂的释放可以在愈合期间持续进行，或者作为对环境刺激的响应而周期性释放。第二种情况可以称为“智能”药物输送，可以通过在特定刺激事件（如pH值变化、温度升高或特定酶的存在）后改变其性质的生物材料来实现[13]、[14]、[15]。
在这项工作中，我们旨在开发和评估改良的壳聚糖衍生物作为牙科应用中“智能”药物输送的潜在生物材料[16]、[17]、[18]。壳聚糖是一种由D-葡萄糖胺和N-乙酰-D-葡萄糖胺组成的线性多糖。由于其出色的生物特性（如生物相容性和固有的生物活性），它在组织工程和再生医学中找到了广泛的应用。在酸性条件下（pH < 6.5），壳聚糖结构中的氨基团发生质子化（-NH3+），从而增强其水溶性。当pH值恢复到碱性时，氨基团恢复为中性（-NH2），溶解度显著下降。壳聚糖对pH变化的这种敏感性使其成为对抗感染的“智能”输送的理想候选材料，因为细菌生物膜的形成与低pH微环境有关，而低pH环境是细菌代谢的结果。为了进一步改善聚合物的性能，探索了用两性离子分子修饰壳聚糖的方法。先前的研究表明，这种修饰可以用来控制膨胀性、溶解度和溶解速率等参数，这些参数对药物扩散和释放动力学至关重要，通过引入对环境pH值高度敏感的额外离子相互作用[19]、[20]。在这项工作中，使用了含有磺酸基的两性离子分子，如[2-(甲基丙烯酰氧)乙基]二甲基-(3-磺丙基)氨醇（Sbma）、2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸（Amps）、2-磺苯甲酸环酐（Sba）以及Sba、纯壳聚糖和香草醛的混合物来调整聚合物的性能。香草醛（4-羟基-3-甲氧基苯甲醛，VA）是一种含有酚基和羟基的酚类化合物。醛基和酚基使得香草醛成为一种出色的天然pH敏感交联剂，可以通过与伯胺基形成可逆的席夫碱连接以及广泛的氢键相互作用来增强壳聚糖的药物释放性能[21]、[22]。此外，香草醛具有生物相容性和无毒性，使其成为生物医学应用中传统合成交联剂的吸引人的替代品，确保了长期的安全性。
为了开发有效的LDD系统，考虑植入部位的预期体内条件以及生物材料与周围微环境的相互作用至关重要，因为这些因素显著影响药物释放机制[23]、[24]、[25]。生物流体（如血液、唾液）的流速以及液体体积与样品质量的比例等变量会显著影响质量传递机制和最终的药物释放曲线。对于“智能”LDD系统来说，情况更为复杂，因为还需要评估材料在动态条件下的响应。目前，既没有适当的工具来在动态条件下测试这些材料，也没有合适的变量或无量纲数来比较它们对周围微环境变化的响应速度和程度。在Oates和Anastasiou的最新研究中[23]，已经证明微流控工具可以用于在不同稳态和动态条件下测试材料。在这种系统中，样品质量与周围液体体积的比例更接近体内实际情况，从而产生更准确的化学梯度，这是质量传递和药物释放的驱动力[26]、[27]、[28]。由于涉及的液体体积较小，可以更好地控制pH值、流速和温度，因此可以在动态条件下测试样品。结合在线光谱仪，这些工具有助于更准确地评估材料在LDD开发过程中的性能，并显示出与传统溶解设置相比的明显优势。在这项工作中，使用了类似于[23]中展示的微流控工具来评估材料在稳态和动态条件下的性能。考虑到材料的潜在牙科应用，微流控系统中复制了口腔环境的各个方面，并通过在线光谱获得了药物释放曲线。引入了一个新的响应性变量来比较材料在动态条件下的性能，并量化施加pH刺激时药物释放的变化。然后对选定的聚合物进行了细胞毒性评估，并在含有常见口腔细菌和人类牙周韧带细胞的微流控生物反应器中进行了测试。
部分摘录
壳聚糖衍生物的合成
壳聚糖（CAS编号：9012-76-4，Kraeber & Co GmbH，德国埃勒贝克）的衍生物是通过与三种两性离子单体进行修饰合成的：(a) 2-(甲基丙烯酰氧)乙基二甲基-(3-磺丙基)氨醇（Sbma）（CAS编号：3637-26-1，Sigma-Aldrich，德国达姆施塔特），(b) 2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸（Amps）（CAS编号：15214-89-8，Thermo Fisher，德国坎德尔），以及(c) 2-磺苯甲酸环酐（Sba）（CAS编号：81–08-3，Thermo Fisher，坎德尔）
材料表征
图2a展示了壳聚糖衍生物的溶解度结果。壳聚糖（CS）在酸性pH值下可溶，但在中性或碱性环境中不溶，这是由于其化学结构所致。在pH 4时溶解度较高，但在pH 5时急剧下降，随后随着pH值的升高而保持稳定。这种行为归因于pH值低于6时氨基团的质子化（-NH3+），使聚合物可溶。当pH值超过6时，氨基团恢复为中性（-NH2），溶解度显著下降。
4.0 结论
本研究利用新型微流控生物反应器系统，对pH响应型壳聚糖衍生物进行了系统的评估，以实现局部“智能”药物输送。通过使用两性离子（Amps、Sbma）和酚类（香草醛）分子进行功能化处理，合成了七种衍生物，每种衍生物都旨在增强壳聚糖的化学性质、膨胀性和溶解性。全面的物理化学分析证实了成功的修饰，并揭示了两性离子和酚类分子的作用
CRediT作者贡献声明
威廉·奥茨（William Oates）：撰写——原始草稿、方法学、实验研究。伊奥annis Tsamesidis：撰写——原始草稿、实验研究。乔治亚·米哈伊利杜（Georgia Michailidou）：方法学、实验研究。埃维·克里斯托杜卢（Evi Christodoulou）：撰写——原始草稿、方法学、实验研究。玛丽亚·布斯纳基（Maria Bousnaki）：方法学、实验研究。兰布里尼·帕帕多普洛（Lambrini Papadopoulou）：实验研究。迪米特里奥斯·比基阿里斯（Dimitrios Bikiaris）：撰写——审稿与编辑、资金获取、概念构思。埃莱安娜·康托纳萨基（Eleana Kontonasaki）：撰写——审稿与编辑、监督、资源提供
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢欧盟资助的I-SMarD（项目编号：953128）提供的财务支持。
