双硫仑通过抑制Caspase-1/11-GSDMD焦亡通路与调控SLC7A11-NOX4-ARP2轴缓解脑缺血再灌注损伤中的微胶质细胞焦亡及类二硫化物凋亡样细胞骨架/线粒体改变

《Brain Research Bulletin》：Giving Old Drugs New Life: Disulfiram Alleviates Microglial Pyroptosis and Disulfidptosis-like Cytoskeletal/Mitochondrial Alterations in Cerebral Ischemia-reperfusion Injury

本研究针对血管内治疗诱发的脑缺血再灌注损伤（CIRI）中神经炎症损伤难题，聚焦微胶质细胞焦亡（pyroptosis）与新兴细胞死亡形式二硫化物凋亡（disulfidptosis）的关联机制。团队通过建立大鼠大脑中动脉阻塞（MCAO）模型，发现高剂量双硫仑（DSL，500 mg·Kg-1d-1）可显著改善神经功能，缩小梗死体积，并抑制GSDMD-N端、caspase-1 p10等焦亡相关蛋白表达，同时调节SLC7A11-NOX4-ARP2轴减轻细胞骨架塌陷。该研究首次揭示DSL通过双通路协同作用发挥神经保护效应，为老药新用提供了关键实验依据。

　　

脑卒中作为全球公共卫生的重大威胁，其治疗手段如静脉溶栓和血管内治疗虽能挽救生命，却也可能带来令人头疼的副作用——脑缺血再灌注损伤（Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury, CIRI）。这一病理过程就像“救火时泼水过多导致家具受损”，氧化应激和炎症级联反应是核心破坏者。在这其中，中枢神经系统的常驻免疫细胞——微胶质细胞扮演了关键角色，它们一旦过度激活引发焦亡（pyroptosis），就会导致细胞膜破裂、内容物释放，加剧神经损伤。有趣的是，传统对焦亡的理解多集中在Gasdermin D（GSDMD）介导的膜孔形成，但研究者敏锐地发现，焦亡过程中伴随的细胞收缩现象，似乎还藏着另一个“幕后黑手”——细胞骨架塌陷。恰逢近年学界提出一种名为二硫化物凋亡（disulfidptosis）的新型细胞死亡方式，其特征正是细胞骨架崩溃。这不禁让人猜想：在CIRI的微胶质细胞中，焦亡和二硫化物凋亡是否会“狼狈为奸”？老药双硫仑（Disulfiram, DSL）能否成为打断这场“死亡二重奏”的指挥家？带着这些疑问，来自广州中医药大学第二临床医学院的研究团队开展了一项深入探索，相关成果发表在《Brain Research Bulletin》上，揭示了DSL通过多靶点抑制神经炎症的新机制。

为了回答上述问题，研究人员构建了雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠的大脑中动脉阻塞（MCAO）模型，并设置假手术组、I/R模型组及低、中、高剂量DSL干预组。关键技术手段包括：采用TTC染色和Zea Longa评分评估梗死体积与神经功能；利用激光散斑对比成像（LSCI）观察脑血流灌注与大血管直径；通过透射电子显微镜（TEM）观察细胞和线粒体的超微结构；运用Western Blot（WB）和多重免疫荧光（TSA-IF）检测焦亡（GSDMD、caspase-1/11）与二硫化物凋亡（SLC7A11、NOX4、ARP2）相关蛋白的表达与共定位；结合非标记定量蛋白质组学（LC-MS/MS）分析差异表达蛋白的通路富集；并通过ELISA法测定脑组织中的Cys-SS-Cys、NADPH及蛋白二硫键异构酶（PDI）含量。

3.1. High-dose DSL reduced infarct volume and improved neurological function at the early stage of CIRI

通过TTC染色和Zea Longa评分发现，与I/R组相比，高剂量DSL（500 mg·Kg^-1d^-1）在再灌注24小时后显著减小了梗死体积（p = 0.0306），并改善了大鼠的神经功能缺损评分（p = 0.0458）。这表明DSL在早期CIRI阶段具有显著的神经保护作用。

3.2. DSL preserved the diameter of large vessels in the ischemic hemisphere

激光散斑成像显示，I/R组缺血半球大血管直径较假手术组显著缩小（p = 0.0399），而DSL-H组则有效维持了大血管直径（p = 0.0406），减少了双侧半球血管直径的差距。尽管脑灌注量未达统计学差异，但血管结构的保护有利于微循环稳定。

3.3. DSL partially preserved cellular morphology in the ischemic hemisphere

HE染色结果显示，I/R组在梗死核心、半暗带及海马CA1区均出现明显的神经元萎缩和细胞外基质破坏。DSL-H组在半暗带的神经元收缩程度显著轻于I/R组，提示DSL对局部组织形态具有保护效应。

3.4. Proteomic analysis of DSL in the ischemic hemisphere

蛋白质组学分析显示，与I/R组相比，DSL-H组在缺血半球显著上调84种蛋白、下调331种蛋白。GO富集分析表明差异蛋白集中于细胞外区域、质膜外侧面及丝氨酸型内肽酶活性等；KEGG分析则指向肌动蛋白细胞骨架的调节，提示DSL可能通过影响细胞骨架相关通路发挥作用。

3.5. DSL inhibited pyroptosis of the caspase-1/11-GSDMD pathway at the infarct edge

WB结果表明，DSL显著抑制了梗死边缘区GSDMD-N末端（GSDMD-NT）的表达（p = 0.0199），并降低了caspase-1（p10）和caspase-11的切割活化水平（分别为p = 0.0289和p = 0.0350）。同时，促进膜破裂的Ninjurin-1（NINJ1）表达也被DSL显著下调（p < 0.0283）。下游因子检测显示，IL-18水平被显著抑制（p = 0.0037），证实了DSL对经典焦亡通路的阻断作用。

3.6. DSL inhibited disulfidptosis-like changes of the SLC7A11-NOX4-ARP2 pathway at the infarct edge

多重免疫荧光显示，在半暗带微胶质细胞中，焦亡标志物GSDMD与二硫化物凋亡关键转运蛋白SLC7A11存在共定位。DSL-H组显著减少了Iba-1⁺/GSDMD⁺/SLC7A11⁺三阳性细胞数量（p = 0.0110），并恢复了SLC7A11的表达（p = 0.0010），同时抑制了NOX4（p = 0.0070）和肌动蛋白相关蛋白2（ARP2）（p = 0.0014）的表达。此外，脑组织中Cys-SS-Cys和蛋白二硫键异构酶（PDI）含量的升高，进一步支持了DSL对二硫化物代谢的调节作用。

3.7. The reduction of mitochondrial membrane rupture by DSL may be related to the DRP1/VDAC1

透射电镜观察到，DSL-H组微胶质细胞的线粒体膜结构较I/R组更为完整。分子机制上，DSL显著抑制了动力相关蛋白1（DRP1）的表达（p = 0.0217），并降低了电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）的水平（p = 0.0494），提示其可能通过调节DRP1/VDAC1轴减轻线粒体碎片化与钙稳态失衡。

综合全文，该研究首次提出并证实在CIRI模型中，微胶质细胞的焦亡过程可能伴随着二硫化物凋亡样的细胞骨架改变。双硫仑（DSL）作为一种已获批的老药，展现出了“一石二鸟”的潜力：一方面，它像一把“分子剪刀”，通过抑制caspase-1/11-GSDMD信号轴，直接阻止了焦亡性膜孔的形成；另一方面，它又像一位“骨架守护者”，通过调节SLC7A11-NOX4-ARP2轴，缓解了因氧化应激导致的细胞骨架塌陷。此外，DSL对线粒体动力学关键分子DRP1和VDAC1的调控，也为其神经保护机制增添了线粒体层面的证据。尽管研究中仍存在标志物特异性、DSL临床转化剂量安全性等问题，但这项工作无疑为理解CIRI复杂的细胞死亡机制提供了全新视角，并为DSL这一廉价老药的“老药新用”提供了扎实的临床前实验基础，有望在未来急性缺血性卒中的辅助治疗中开辟新路径。