《Cell Biomaterials》：Nascent extracellular matrix: The missing piece in hydrogel design
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这篇前瞻性综述聚焦于三维细胞培养中一个常被忽视的关键界面——新生细胞外基质（nECM）。文章创新性地提出了细胞、水凝胶与nECM间的三方互作模型，系统阐述了nECM作为细胞命运“第三调控者”的机制与功能，并展望了通过化学与蛋白质工程直接“编辑”nECM，以实现对细胞-基质互作的精准操控，为下一代体外培养系统和组织工程提供了新范式。
在生命科学领域，三维水凝胶培养系统已被广泛用于模拟体内的细胞外基质（ECM）微环境，以研究细胞命运。然而，传统的水凝胶设计大多假设细胞直接响应于预先设计的水凝胶信号。近年来，越来越多的证据表明，多种细胞类型在嵌入水凝胶后会迅速沉积新合成的、处于早期形成阶段的ECM，即新生细胞外基质（nECM）。这一发现正在重塑我们对细胞-基质相互作用的根本理解。
nECM：细胞-水凝胶信号传递中的“第三方玩家”
过去，细胞与ECM之间“双向互惠”的动态关系是核心范式。如今，研究发现nECM在细胞-水凝胶界面快速积累并组装，形成了一个具有独特生物化学和生物力学特性的新界面。这促使我们将传统的“双向”模型扩展为细胞、nECM和水凝胶之间的“三方互作”。
nECM的沉积具有普遍性，已在间充质基质细胞、软骨细胞、胶质母细胞瘤细胞等多种细胞类型中观察到，并跨越聚乙二醇（PEG）、藻酸盐、透明质酸等多种水凝胶化学体系。其沉积的“量”与“构”受到水凝胶初始性能的深刻影响。例如，更软、更具降解性和渗透性的基质有利于大分子扩散，往往会产生更厚的nECM层；而引入RGD（Arg-Gly-Asp）肽等生化功能化修饰，虽能增强细胞粘附，却可能减少nECM的产生。nECM的积累甚至会改变或物理性推开初始的水凝胶，其力学性能可能独立于水凝胶的初始模量。至关重要的是，nECM介导的反馈信号被证明在调节细胞命运（如谱系决定、细胞铺展）中扮演着主导角色，当缺乏nECM或其反馈时，这些基本细胞行为会被扰乱。
nECM表征：多维度解码新生基质
深入研究nECM的功能并将其整合进水凝胶设计策略，需要一套强大的分析工具来表征其时空调控下的力学与生化特性。
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时空图谱绘制：核心方法是利用非经典氨基酸（如L-叠氮高同型半胱氨酸, AHA）或糖类似物进行代谢标记，再通过生物正交点击化学（如铜催化叠氮-炔环加成, CuAAC；或应变促进的叠氮-炔环加成, SPAAC）进行荧光可视化。为提高特异性，还可使用叠氮脯氨酸特异性标记胶原、Ac4GalNAz标记糖蛋白等。此外，结合稳定同位素示踪（SIP）的拉曼光谱或受激拉曼散射（SRS）显微术，提供了无标记或低扰动观察nECM的新途径。
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力学与结构性能测量：原子力显微镜（AFM）是测量nECM局部压痕模量的关键工具，通过荧光引导的AFM可以在细胞-水凝胶界面进行高空间分辨率的力学图谱绘制。在结构分析方面，诸如TWOMBLI、BoneJ、SOAX等图像分析流程或插件，可用于量化nECM纤维网络的厚度、孔径、连通性、排列和曲率等结构参数。
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生化特性表征：细胞外蛋白质识别流式细胞术（EPIC）等新技术允许在单细胞水平上对nECM进行表征和分选。基于质谱的蛋白质组学，结合如Matrisome项目开发的生物信息学资源（Matrisome AnalyzeR, MatrisomeDB），能够全面鉴定nECM的分子组成。通过富集叠氮修饰的nECM蛋白质，可以区分新沉积与已有的ECM。基质辅助激光解吸/电离质谱成像（MALDI-MSI）则有望实现nECM蛋白质的原位空间分布鉴定。
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功能验证实验：为探究nECM的功能，研究者采用了多种扰动策略。例如，使用邻近连接实验（PLA）检测nECM蛋白（如胶原VI）与细胞整合素之间的相互作用；通过添加可溶性RGD肽或功能阻断抗体来竞争性抑制细胞与nECM的结合；利用外泌抑制剂Exo-1阻断nECM的分泌；或通过CRISPR-Cas9基因编辑、RNA干扰等技术在转录或翻译水平上敲低特定ECM元件的表达，以研究其下游通路。
4D nECM工程：从间接到直接的精准操控
认识到nECM的关键作用后，一个前沿愿景是将水凝胶工程策略转化为对nECM本身的调控。这包括间接和直接两条路径。
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间接nECM工程：通过调控水凝胶的特性来引导nECM的沉积。例如，添加生长因子、改变氧浓度等生化信号；设计具有特定模量、降解性、粘弹性和扩散性的水凝胶网络——应力松弛或可降解水凝胶通常能增强nECM的积累和分布；以及在水凝胶中功能化能够特异性捕获细胞分泌的ECM蛋白（如纤连蛋白、层粘连蛋白）的配体，从而将nECM保留在所需位置。
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直接nECM工程：这是一条更具革新性的思路，即将nECM本身视为一种可工程化的材料，利用化学工具直接修饰其性能。这包括：
- 1.
基于天然氨基酸的化学：利用酪氨酸残基，通过钌/过硫酸钠（Ru/SPS）介导的光交联实现时空精准的二酪氨酸键形成，从而局部硬化nECM；或利用酪氨酸酶、辣根过氧化物酶进行交联。赖氨酸残基丰富的伯胺也可用于多种偶联反应。
- 2.
工程化肽段基序：例如，将分选酶A（Sortase A）识别的LPXTG基序引入ECM蛋白，从而利用分选酶A将含有GGG的底物（可以是生物活性线索、交联剂等）特异性地连接到nECM上。
- 3.
代谢标记与点击化学：将含有叠氮等点击化学反应手柄的非天然氨基酸或糖类似物代谢掺入nECM，随后通过点击化学连接各种功能分子（如细胞粘附肽RGD）、聚合物或交联剂，从而精确赋予nECM新的生化或力学特性。
展望：通往精准细胞调控的新维度
nECM的发现和深入研究正在改变我们利用三维培养系统研究细胞功能的方式。未来，该领域需要在开发先进的nECM定量表征工具、系统分析水凝胶设计如何调控nECM、以及评估不同细胞类型nECM特性的异质性等方面持续探索。通过整合新一代表征工具与水凝胶化学的进展，直接对nECM进行工程化操控，将为我们带来前所未有的机遇：利用水凝胶设计可控地构建nECM以用于组织工程；创建能更准确预测体内组织行为的培养模型；以及开发基于nECM工程的新治疗策略。将nECM这块“缺失的拼图”纳入设计蓝图，标志着我们向在体外精准重建并操控复杂细胞微环境迈出了关键一步。
