发现喹诺沙啉-查尔酮衍生物作为共价型秋水仙碱结合位点抑制剂，用于乳腺癌和纤维肉瘤的治疗

《European Journal of Medicinal Chemistry》：Discovery of Quinoxaline-Chalcone Derivatives as Covalent Colchicine Binding Site Inhibitors for Breast and Fibrosarcoma Treatment

本研究基于S-Ⅳ-25设计合成了系列新型共价喹诺酮-查耳酮衍生物，通过结构活性关系分析发现化合物10v具有显著抗增殖活性，通过共价结合抑制微管聚合及细胞周期，克服多药耐药性，其体内抗肿瘤效果优于紫杉醇。

　　

卢璐|王子瑜|刘丽歌|耿晓青|张浩文|王绍奇|梁婷婷|张亚红|王建红

中国河南省开封市河南大学天然药物创新与转化重点实验室，邮编475004

摘要

针对秋水仙碱结合位点是克服微管靶向药物所面临的多药耐药性的一个有吸引力的药理学策略。本文通过将S-Ⅳ-25作为先导化合物，合理设计了一系列新型的共价喹诺酮-查尔酮衍生物。所有获得的目标化合物都经过了抑制活性评估，并总结了结构-活性关系，最终鉴定出一种强效的秋水仙碱结合位点抑制剂10v。10v对三种癌细胞系（HT-1080、MCF-7、MDA-MB-231）表现出最强的抗增殖活性，并进一步抑制了细胞集落形成和迁移。机制研究表明，10v通过与微管蛋白上的秋水仙碱结合位点发生共价结合，抑制了微管蛋白的聚合并破坏了微管网络。进一步的机制分析发现10v使细胞周期停滞在G2/M期，并通过线粒体介导的途径诱导细胞凋亡。更重要的是，10v通过共价结合和抑制P-gp转运蛋白，对MCF-7/ADM细胞表现出抗增殖活性。同时，分子对接结果表明10v占据了秋水仙碱结合位点并与β-Cys239发生了共价结合。最后，体内实验表明10v的抗癌效果优于紫杉醇，且安全性良好。

引言

微管是真核细胞中由α/β-微管蛋白异二聚体组成的动态细胞骨架纤维，参与多种细胞功能，如细胞运动、细胞内物质运输和有丝分裂1, 2。鉴于微管在这些细胞功能中的关键作用，它们被视为癌症治疗的一个极具吸引力的靶点³。迄今为止，已有几种微管靶向药物（MTAs），如紫杉醇、多西他赛和长春新碱，被批准用于临床治疗4, 5。尽管这些药物在癌症治疗中取得了显著疗效，但其应用受到获得性多药耐药性（MDR）、不良的药代动力学（PK）特性和严重的系统性毒性的严重限制6, 7。

秋水仙碱结合位点（CBS）位于α-和β-微管蛋白亚基的交界处。靶向该位点的抑制剂可以抑制微管蛋白的聚合，扰乱细胞周期，最终导致肿瘤细胞死亡8, 9, 10。此外，秋水仙碱结合位点抑制剂（CBSIs）还表现出强烈的血管破坏和抗血管生成活性11, 12。更重要的是，CBSIs能够克服由ABC（ATP结合盒）转运蛋白过表达、β-Ⅲ微管蛋白亚型上调以及微管蛋白突变引起的MTAs的多药耐药性7, 8, 13, 14, 15, 16。目前，已有几种CBSIs进入临床试验阶段，例如Combretastatin A-4（CA-4）、Oxi4503、VERU-111、Verubulin和KX-2-361（图1）15, 17, 18, 19, 20, 21, 22。然而，由于治疗窗口窄和药代动力学特性不佳（如亲水性差23, 24, 25），这些CBSIs尚未获得临床批准。因此，开发新型CBSIs是癌症治疗的一个有前景的策略。

与非共价抑制剂相比，共价抑制剂具有明显的优势，包括更高的效力、更高的选择性、更持久的治疗效果、更低的系统毒性以及更低的药物耐药性26, 27。根据已发表的文献，已有几种共价CBSIs通过与β-微管蛋白的共价结合而发挥作用（图2）。越来越多的证据表明，某些共价CBSIs不仅抑制微管蛋白的聚合，还能通过促进间接的蛋白酶体依赖性微管蛋白降解来降低细胞内的微管蛋白水平28, 29, 30。此外，如异硫氰酸酯（ITCs）、T138067、Millepachine（MIL）等共价CBSIs在多药耐药性细胞中仍保持强烈的抑制活性，证实了共价抑制剂能够有效规避多药耐药性28, 29, 31, 32。

最近，我们发现S-Ⅳ-25是一种新型CBSI，它能够强效抑制微管蛋白聚合并表现出显著的抗肿瘤活性。分子对接研究预测了S-Ⅳ-25与微管蛋白的结合模式，发现A环嵌入一个疏水口袋中，而B环则夹在βN258和βK352之间。此外，B环的NH基团与αT179的羰基形成了氢键³³。α, β-不饱和酮结构单元是生物活性分子中常见的结构基元，已被用作CBSIs开发中的连接臂，MIL就是一个例子。MIL-微管蛋白复合物的X射线晶体结构显示，MIL的C环和D环占据了疏水口袋并形成了关键的疏水相互作用；然而未观察到氢键的形成31, 34。受这些发现的启发，我们通过药效团融合策略，在喹诺酮衍生物的连接臂区域引入α, β-不饱和酮结构单元，旨在基于喹诺酮骨架设计共价CBSIs。我们假设E环将位于α/β-微管蛋白交界处并与αT5形成氢键，F环将占据β-微管蛋白中的更深疏水口袋，连接臂将与β-微管蛋白发生共价结合。这种设计有望增强抗增殖活性并有效克服药物耐药性（图3）33, 35。本文报告了新型喹诺酮衍生物作为共价CBSIs的设计、合成和生物学评估。

化学部分

目标化合物的合成路线分别在方案1、方案2和方案3中概述。化合物2 ～ 7按照我们之前发表的研究方法33, 35进行合成。起始材料1a ～ 1d在K₂CO₃和KI的存在下与苄溴反应，生成中间体2a ～ 2d，随后将硝基还原为氨基。随后，将二胺衍生物3a ～ 3d与草酸二乙酯环化合成

结论

微管参与多种细胞功能，已成为癌症治疗的一个有吸引力的靶点。秋水仙碱结合位点抑制剂（CBSIs）因其能够克服多药耐药性而受到广泛关注——这是微管靶向药物面临的主要限制。然而，迄今为止，尚无CBSIs获得临床批准用于癌症治疗。本文报告了我们开发新型共价CBSIs用于癌症治疗的努力。

一般信息

除非另有说明，所有化学品和试剂均未经进一步纯化直接使用。反应通过薄层色谱（TLC）进行监测。¹H NMR和¹³C NMR谱在Bruker Advance 300仪器上记录（¹H NMR：300 MHz，¹³C NMR：75 MHz），以TMS作为内标，参考物质为氘代二甲砜（DMSO-d₆）或氘代氯仿（CDCl₃）。化学位移（δ）以百万分之一（ppm）表示，偶联常数（J）也以相应单位给出

CRediT作者贡献声明

王建红：撰写、审稿与编辑、资金获取。卢璐：验证、方法学研究。梁婷婷：初稿撰写、审稿与编辑、资金获取。王绍奇：撰写、审稿与编辑。张亚红：撰写、审稿与编辑、资金获取。刘丽歌：验证。王子瑜：验证、方法学研究。张浩文：验证。耿晓青：验证、方法学研究

伦理批准

动物模型的实验程序获得了河南大学动物护理和使用委员会（IACUC编号：HUSOM2020-049）的批准。

注释

作者声明没有利益冲突。

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的利益冲突或可能影响本文工作的个人关系。

致谢

本工作得到了河南省高等学校重点科研计划（资助编号24A350001）、国家抗病毒药物重点实验室开放项目以及河南省重点科技项目（资助编号242102310439；242102310311）的支持。我们感谢国家认证细胞库提供的HT-1080细胞。