《Fish & Shellfish Immunology》：Genome-wide identification, expression analysis and antiviral function of RIG-I-like receptors (RLRs) in basal chordate
Branchiostoma japonicum
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本研究系统鉴定了头索动物 Branchiostoma japonicum 中 RLRs 的分布及进化特征，发现其包含 RIG-I 和 MDA5 两个亚家族，并通过过表达实验揭示 BjMDA5a 具有剂量依赖性抑制春季病毒性出血症病毒（SVCV）细胞增殖的作用，而 BjRIG-Ia 则显著下调多种抗病毒信号通路相关基因表达，为解析脊椎动物抗病毒免疫网络起源提供了新依据。
杜月英|邓宇航|刘瑞雪|袁家玲|王云霞|王苏|聂萍|宋晓军
中国青岛市青岛农业大学海洋科学与工程学院比较免疫学实验室
摘要：
视黄酸诱导基因I（RIG-I）样受体（RLRs）作为关键的细胞质RNA传感器，在抗病毒先天免疫中发挥着重要作用。然而，基干脊索动物中RLRs的分布、进化动态及其抗病毒功能仍知之甚少。在本研究中，我们调查了从单细胞真核生物到哺乳动物中RLRs的分布和进化模式，并进一步研究了基干脊索动物Branchiostoma japonicum的抗病毒先天免疫反应。研究结果表明，RLRs广泛存在于从海绵到哺乳动物的各种后生动物中：无脊椎动物中有两个亚家族（RIG-I和黑色素瘤分化相关蛋白5，MDA5），脊椎动物中有三个亚家族（RIG-I、MDA5和遗传与生理学实验室2，LGP2），其进化特征包括基因复制和丢失、结构域重排以及正选择。急性免疫挑战实验表明，在B. japonicum中感染poly(I:C)、LPS和poly(dA:dT后，RLRs的表达显著改变。亚细胞定位分析显示，BjRIG-Ia和BjMDA5a主要分布在细胞质中。过表达实验表明，过表达BjMDA5a可以上调多个RLR信号通路基因的表达，如DHX58、TBK1、IFNα、IRF3、IRF7、ISG15、ATG12和TNFα；相反，过表达BjRIG-Ia则显著下调DHX58、ATG12、IκBα、IRF3、IRF7、ISG15、p65和p50的表达。鉴于MDA5在抗病毒免疫中的作用，结晶紫染色实验表明，BjMDA5a以剂量依赖的方式抑制了鲤鱼病毒（SVCV）在细胞水平上的复制。本研究为了解脊索动物中抗病毒调控网络的起源和进化提供了宝贵的见解。
引言
动物演化出了两套免疫系统来抵御病原微生物的入侵，即先天免疫系统和获得性免疫系统。先天免疫系统是第一道防线，其有效性依赖于模式识别受体（PRRs）对病原体相关分子模式（PAMPs）的精确识别[1]。这种识别会触发信号级联反应，最终产生控制病原体所需的炎症和抗病毒因子。PRRs大致分为五个家族：CLRs（C型凝集素受体）、NLRs（Nod样受体）、TLRs（Toll样受体）、CDS（胞质DNA传感器）和RLRs（视黄酸诱导基因I（RIG-I）样受体）[2]。其中，RLRs已成为病毒RNA的关键细胞质传感器。在识别RNA后，RLRs会招募适配蛋白（如MAVS或TRIF）来激活I型干扰素（IFNs）反应，进而诱导数百个IFN刺激基因（ISGs），从而建立抗病毒状态[3]、[4]、[5]。
RLRs包含三个成员：RIG-I、黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5）和遗传与生理学实验室2（LGP2），它们都含有一个中心解旋酶结构域和一个负责RNA结合的C末端结构域（CTD）[6]、[7]。RIG-I和MDA5还具有N末端半胱天冬酶激活和招募结构域（CARDs），这些结构域介导下游信号传导，而LGP2缺乏CARDs，被认为调节其他两个受体[8]、[9]、[10]。结构研究表明，RIG-I在缺乏RNA时呈自我抑制构象，当配体结合时会释放这种构象，使其CARDs暴露出来，从而进行泛素依赖的寡聚化和信号传导[11]。相比之下，MDA5沿长双链RNA组装成螺旋丝状结构，从而激活信号传导[12]、[13]、[14]。
RLRs在各种后生动物中广泛存在，在无脊椎动物（如Caenorhabditis elegans、Crassostrea gigas、Chlamys farreri、Lampetra japonica）和脊椎动物[15]、[16]、[17]、[18]、[19]中都发现了功能同源物。在软体动物中，C. farreri和C. gigas的RLRs通过与MAVS相互作用并激活NF-κB信号通路来响应双链RNA类似物或病毒感染，这表明了无脊椎动物中RLRs的保守抗病毒功能[16]、[17]、[18]。在七鳃鳗中，RLRs和TLRs通路共同调节病毒感染期间的IFNs反应和细胞凋亡[19]。这些发现表明，无脊椎动物的RLRs具有真正的PRRs功能，具有抗病毒作用。
在鱼类中，RLRs的信号传导与哺乳动物系统更为相似。斑马鱼RIG-I和MDA5通过MAVS激活I型IFN启动子，提供对RNA病毒（如SVCV和蛇头囊病毒（SHVV）的保护[20]、[21]、[22]、[23]、[24]。在草鱼中观察到RIG-I和MDA5之间的功能冗余，而LGP2在IFN信号传导中起依赖于上下文的调节作用，这受到病毒类型和感染动力学的影响[5]、[25]、[26]。总体而言，这些研究展示了RLRs在脊椎动物中的进化保守性和功能多样性。
尽管在模式生物方面取得了进展，但在处于与脊椎动物亲缘关系最近的头索动物——文昌鱼中，RLRs的存在及其功能意义仍不清楚。由于其已测序的基因组和基因编辑工具的发展，文昌鱼已成为比较免疫学和进化发育生物学中的重要模型[27]、[28]、[29]、[30]、[31]。因此，研究该物种中的RLRs可能为了解脊椎动物抗病毒免疫网络的起源和早期进化提供关键见解。在本研究中，我们系统地鉴定了文昌鱼基因组中的RLR家族成员，分析了它们的进化动态，并研究了它们在抗病毒免疫中的功能作用。我们的发现有助于更深入地理解脊椎动物中抗病毒信号通路的进化过程。
实验部分
文昌鱼的培养
成熟的文昌鱼成体（Branchiostoma japonicum）来自中国山东省青岛市，在循环水养殖系统中以22-25°C的温度饲养，并每天喂食混合藻类液体。本研究及动物使用均得到了青岛农业大学海洋科学与工程学院的批准，并遵循了国家关于实验动物使用和护理的一般标准。
后生动物中RLRs的鉴定
研究结果显示，RLRs广泛存在于从海绵到哺乳动物的基因组中，其进化历史中存在基因复制和丢失的现象（图1）。例如，在青鳉和鸡中未检测到RIG-I的同源物。有趣的是，在所有检测到的昆虫和甲壳类动物中，RLRs成员均已丢失。所有鉴定出的RLRs都具有DExDc、ResIII、HELICc和RIG-I_C-RD结构域，但某些RLRs成员缺乏CARD结构域（表S3）。否则，RIG-I和
讨论
病原体与其宿主之间的持续相互作用导致了动态的进化军备竞赛。缺乏适应性免疫的无脊椎动物演化出了多种广泛而多样的先天免疫传感器[32]、[33]。其中，RLRs是一类关键的模式识别受体，参与检测各种动物中的病毒感染[1]。在本研究中，我们调查了从海绵到
数据可用性声明
支持本文结论的原始数据将由作者提供，不附带任何保留条件。
作者贡献
杜月英：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、方法学、数据管理、概念构思。刘瑞雪：方法学、数据管理。袁家玲：方法学、数据管理。王云霞：方法学、数据管理。王苏：撰写——审稿与编辑、方法学、数据管理。聂萍：撰写——审稿与编辑。宋晓军：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿。致谢
本研究得到了中国山东省自然科学基金（项目编号：ZR2023MC141）的支持。此外，还得到了山东省“一流渔业学科”项目和“一事一议（Yishi Yiyi）”人才项目的财政支持。资助方未参与研究设计、数据收集与分析、发表决定或手稿准备。
