在GIFT罗非鱼的cfDNA中，通过全基因组范围识别与无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）耐药性相关的甲基化标记

《Fish & Shellfish Immunology》：Genome-wide identification of methylation markers associated with Streptococcus agalactiae resistance in cfDNA of GIFT tilapia

本研究首次利用全基因组bisulfite测序（WGBS）技术，分析感染链球菌（S. agalactiae）后健康、敏感和耐药尼罗 tilapia血浆cfDNA的甲基化特征，发现cfDNA浓度在敏感组显著升高，并与脾脏等免疫相关组织甲基化标记存在强相关性（R=0.928），为鱼类抗病育种提供非侵入性检测方法。

　　

Ji Ping Jiao|Tao Fei Qiao|Meng Fan Dong|Zong Xian Zhu|Jin Min Pan|Jun Hong Xia

中国广东省中山大学生命科学学院水产经济动物研究所生物控制国家重点实验室及广东省水产经济动物重点实验室，广州510275

摘要

传统上，通过侵入性组织活检来评估鱼类DNA甲基化情况，这限制了其在体内监测和抗性个体遗传选择中的应用。作为一种非侵入性方法，血浆循环游离DNA（cfDNA）检测已成为研究个体表观遗传状态和免疫反应的新策略。本研究利用全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）技术，分析了受无乳链球菌感染后的尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）GIFT品系的基因组范围甲基化谱型。易感组的cfDNA浓度（2.72 ± 1.46 ng/μL）显著高于对照组（1.12 ± 0.38 ng/μL）和抗性组（1.23 ± 0.72 ng/μL）。在抗性组和易感组之间共鉴定出3,076个差异甲基化区域（DMRs），这些DMR相关基因在转录调控、免疫反应和能量代谢途径中显著富集。通过整合已发表的脾脏甲基化数据并进行脾脏RNA-seq分析，我们进一步探讨了cfDNA甲基化标记的潜在组织来源。大约7.6%的cfDNA DMRs（234个）与脾脏DMRs重叠，其中111个具有相同甲基化方向的DMR在cfDNA和脾脏数据集之间显示出强相关性（R = 0.928，p < 1.31e - 48）。cfDNA中的启动子甲基化水平与脾脏转录组数据中的基因表达呈负相关。在脾脏数据中检测到的100个差异表达基因（DEGs）也在cfDNA基因数据集中出现，并具有差异甲基化的启动子（DMPs）。BS-PCR和qRT-PCR分析证实，在四个免疫相关组织（脾脏、头肾、肝脏和后肠）中，b4galt1l、pigr和adsl候选基因的甲基化和表达在对照组和感染组之间存在显著差异。总之，本研究为开发针对无乳链球菌抗性的GIFT罗非鱼表观遗传生物标志物提供了宝贵的数据支持，并表明脾脏可能是cfDNA甲基化标记的潜在组织来源。

引言

由于遗传多样性的下降，传统遗传育种的潜力逐渐受到限制。越来越多的证据表明，表观遗传标记会影响动物的基因表达和表型结果。表观遗传介导的育种（epibreeding）可以作为一种有前景的育种策略，以提高动物对环境变化的适应性和生产力，例如在Hu羊[1]、日本比目鱼[2]和罗非鱼[3]中的应用。

动物表观遗传育种的一个限制是样本采集的侵入性，因为DNA甲基化具有高度的组织和细胞类型特异性[4]、[5]。为了克服传统组织活检的局限性，近年来人们开始关注循环游离DNA（cfDNA）中甲基化水平的检测，作为一种非侵入性检测方法[6]。cfDNA由存在于体液（如血液和尿液）中的DNA片段组成，主要来源于凋亡或坏死细胞，或通过主动细胞分泌释放，保留了其来源组织的遗传和表观遗传特征[7]、[8]。在正常生理条件下，cfDNA的释放主要反映了身体通过凋亡和坏死清除衰老或受损细胞的过程[7]、[9]。然而，在恶性肿瘤、创伤、器官移植排斥、器官衰竭和感染等病理情况下，异常的坏死细胞会向血液中释放大量DNA，导致血浆中cfDNA水平显著升高[10]。cfDNA甲基化水平的检测在癌症早期筛查、预后评估、治疗监测和肿瘤免疫相关研究中显示出广泛的应用前景[11]、[12]、[13]。然而，其在鱼类疾病表观遗传学中的潜在价值仍有待探索。

罗非鱼是全球养殖量第二大的鱼类，对全球粮食安全和经济发展至关重要[14]。然而，随着集约化养殖模式的发展，各种疾病的爆发越来越频繁，严重威胁着该行业的稳定性。其中，无乳链球菌（S. agalactiae）是最常见的病原体，导致罗非鱼最高的死亡率和经济损失[15]、[16]。培育抗病品种已成为预防和控制罗非鱼养殖业中无乳链球菌的可持续有效方法[17]。

在罗非鱼中，已鉴定的无乳链球菌疾病SNP标记大多显示出较低的遗传率[3]、[18]、[19]。最近的一项研究在罗非鱼的脾脏和脑组织中鉴定出多个组织特异性的差异甲基化区域（DMRs）和五个可能与无乳链球菌感染抗性相关的显著甲基化QTLs[3]。这表明DNA甲基化可能通过调节关键免疫相关基因的表达来促进疾病抗性。然而，对免疫相关组织（如脾脏）的传统活检取样可能导致鱼类死亡，从而难以将这些表观遗传标记直接应用于育种实践中。

在本研究中，我们首次使用全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）技术对健康、易感和抗性GIFT罗非鱼的血浆cfDNA进行了全基因组甲基化谱型分析。我们鉴定了DMRs并分析了相关基因。此外，通过将cfDNA甲基化数据与我们已发表的脾脏DNA甲基化数据[20]以及本研究中进行的脾脏转录组数据相结合，进一步追踪了cfDNA甲基化标记的潜在组织来源。本研究为理解循环cfDNA甲基化的生物学意义提供了新的证据，并强调了cfDNA甲基化检测作为罗非鱼抗病育种非侵入性方法的潜在应用。

伦理声明

本研究中的所有动物实验均获得了中山大学生命科学学院动物护理和使用委员会的批准。我们已尽一切努力减少GIFT罗非鱼的痛苦。

细菌菌株和培养条件

无乳链球菌菌株（THN0901）由李安兴教授（中山大学）提供。该菌株随后在28°C下用脑心浸液（BHI）培养基培养，并以220 rpm的速度振荡过夜。

实验鱼、细菌挑战实验和样本收集

在广东罗非鱼孵化场建立了一个半同胞家族

无乳链球菌感染后GIFT罗非鱼组织的形态学数据

200条感染无乳链球菌的GIFT罗非鱼在168小时内的累计死亡率为56.5%（补充图1），死亡高峰出现在感染后24小时内。感染后12小时，选择了首批死亡的10条鱼作为S组，占总数量的5%。共有43条鱼在感染后21天内存活且未出现明显临床症状，其中随机选择了10条作为R组。

PBS注射

广泛的组织损伤和细胞凋亡可能是无乳链球菌感染GIFT罗非鱼中cfDNA的重要来源

cfDNA是指存在于各种体液（如血液和尿液）中的片段化DNA分子，主要来源于包括凋亡、坏死和主动分泌在内的细胞过程[7]、[8]。在健康个体中，cfDNA主要来源于造血细胞（包括红细胞和白细胞）以及内皮细胞。然而，在感染或创伤等病理条件下，广泛的组织损伤和细胞死亡会导致cfDNA显著增加

结论

在这项研究中，我们首次利用高分辨率WGBS技术，对感染无乳链球菌的GIFT罗非鱼的cfDNA甲基化模式进行了全面分析。我们的数据清楚地表明，无乳链球菌感染显著降低了cfDNA的整体甲基化水平。同时，cfDNA浓度在感染早期显著升高

声明和声明

相应作者声明在本研究中不存在利益冲突。

数据和材料的可用性

所有读取的数据均可在DDBJ数据库中获取（BioProject Accession: PRJB38032和PRJDB38028）。

利益冲突声明

相应作者声明在本研究中不存在利益冲突。

作者贡献

Jun Hong Xia：概念构思、撰写-审稿和编辑以及监督。Ji Ping Jiao：方法学、软件、可视化、原始草稿准备。Tao Fei Qiao、Meng Fan Dong：表型收集和基因分型。Tao Fei Qiao、Meng Fan Dong、Zong Xian Zhu、Jin Min Pan：方法学、调查、软件。

伦理批准和参与同意

本研究中的所有实验均获得了中山大学生命科学学院动物护理和使用委员会的批准，并按照该委员会制定的规则和指南进行。

出版同意

所有作者均已批准手稿并同意发表。

资助

本工作得到了广东省乡村振兴战略基金（编号：2024-spy-00-004）和国家自然科学基金（编号：32373114）的支持。

致谢

我们感谢所有匿名审稿人对本手稿的评论。